ELISA結合物制備保存方法匯總
酶聯免疫吸附試驗（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，簡稱ELISA）是目前應用最廣泛的免疫學檢測技術，是將抗原-抗體反應的特異性與酶催化作用的高效性相結合，通過酶作用于底物后的顯色反應判定結果。
原理：
測定時，受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應，用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與溶液中的其他物質分開，再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應結合在固相載體上，加入酶反應的底物后，底物被酶催化成有色產物，產物的量與標本中要檢測的目標物質的量直接相關，故可根據顏色的深淺進行定性或定量分析。
結合物即酶標記的抗體（或抗原），是ELISA中最關鍵的試劑。良好的結合物應該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當的分子比例，在結合試劑中應盡量不含有或少含有游離的（未結合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外，結合物尚要有良好的穩定性。
一、結合物的制備
酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊2醛交聯法和guo碘suan鹽氧化法。
1、戊2醛交聯法：
戊2醛是一種雙功能團試劑，它可以使酶與蛋白質的氨基通過它而聯結。堿性磷酸一般用此法進行標記。交聯方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊2醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應后即得酶標記抗體。ELISA中常用的酶一般都用此法交聯。它具有操作簡便、有效（結合率達60%-70%）和重復性好等優點。缺點是交聯反應是隨機的，酶與抗體交聯時分子間的比例不嚴格，結合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯，影響效果。在兩步法中，先將酶與戊2醛作用，透析除去多余的戊2醛后，再與抗體作用而形成酶標抗體。也可先將抗體與戊2醛作用，再與酶聯結。兩步法的產物中絕大部分的酶與蛋白質是以1:1的比例結合的，較一步法的酶結合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯的有效率較一步法低。
2、過碘suan鹽氧化法：
本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標記常用此法。反應時，過碘suan 鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質上的氨基形成Schiff氏堿而結合。酶標記物按克分子比例聯結，其最佳比例為：酶/抗體=1-2/1。此法簡便有效，一般認為是HRP最可取的標記方法，但也有人認為所有試劑較為強烈，各批實驗結果不易重演。
按以上方法制備的酶結合物一般都混有未結合物的酶和抗體。理論上，結合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測定，因經過徹底洗滌，游離酶可被除去，并不影響最終的顯色。但游離的抗體則不同，它會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，從而減少了結合到固相上的酶標抗體的量。因此制備的酶結合物應予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應用。硫酸銨鹽析法最為簡便，但效果并不理想，因為此法只能去除留在上清中的游離酶，但相當數量的游離抗體仍與酶結合物一起沉淀而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，高效液相層析法可將制備的結合物清晰地分成三個部分：游離酶、游離抗體和純結合物而取得最佳的分離效果，但費用較貴。
結合物制得后，在用作ELISA試劑前尚需確定其適當的工作濃度。使用過濃的結合物，既不經濟，又可使本底增高；結合物的濃度過低，則又影響檢測的敏感性。所以必須對結合物的濃度予以選擇。最適的工作濃度就是指結合物稀釋至這一濃度時，能維護一個低的本底，并獲得測定的最佳靈敏度，達到最合適的測定條件和測定費用的節省。就酶標抗體本身而言，它的有效工作濃度是指與其相應抗原包被的載體作試驗時，能得到陽性反應的最高稀釋度。例如某一HRP：抗人IgG制劑標明的工作濃度為1:5000，表示該制劑經1:5000稀釋后，在與人IgG包被的固相作ELISA試驗時，將發生陽性反應。但在用于具體的ELISA檢測中，酶標抗體的最適工作濃度受到固相載體的性質、包被抗原或抗體的純度以及整個檢測系統如標本、反應溫度和時間等的影響，因此必須在實際測定條件下進行"滴配"選擇能達到高敏感度的最大稀釋度作為試劑盒中的工作濃度。
二、結合物的保存
酶標抗體中的酶和抗體均為生物活性物質，保存不當，極易失活。高濃度的結合物較為穩定，冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過程中引起活力的減低，而且使用時需經復溶，頗為不便。結合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的冰格中較長時間保存。早期的ELISA試劑盒中的結合物一般均按以上兩種形式供應，配以稀釋液（見3.2.5）臨用時按標明的稀釋度稀釋成工作液�，F在較先進的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在4-8℃保存期可達6個月。由于蛋白質濃度較低，結合物易失活，需加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結合物加硫柳泵，AP結合物可加疊氮鈉），以防止細菌生長。
三、結合物的稀釋液
用于稀釋高濃度的結合物以配成工作液。為避免結合物在反應中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關蛋白質（例如1%牛血清白蛋白），通過競爭以抑制結合物的吸附。一般還加入具有抑制蛋白質吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20，0.05%的濃度較為適宜。在間接測定抗體時，血清標本需稀釋后進行測定，也可應用這種稀釋液。
原理：
測定時，受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應，用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與溶液中的其他物質分開，再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應結合在固相載體上，加入酶反應的底物后，底物被酶催化成有色產物，產物的量與標本中要檢測的目標物質的量直接相關，故可根據顏色的深淺進行定性或定量分析。
結合物即酶標記的抗體（或抗原），是ELISA中最關鍵的試劑。良好的結合物應該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當的分子比例，在結合試劑中應盡量不含有或少含有游離的（未結合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外，結合物尚要有良好的穩定性。
一、結合物的制備
酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊2醛交聯法和guo碘suan鹽氧化法。
1、戊2醛交聯法：
戊2醛是一種雙功能團試劑，它可以使酶與蛋白質的氨基通過它而聯結。堿性磷酸一般用此法進行標記。交聯方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊2醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應后即得酶標記抗體。ELISA中常用的酶一般都用此法交聯。它具有操作簡便、有效（結合率達60%-70%）和重復性好等優點。缺點是交聯反應是隨機的，酶與抗體交聯時分子間的比例不嚴格，結合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯，影響效果。在兩步法中，先將酶與戊2醛作用，透析除去多余的戊2醛后，再與抗體作用而形成酶標抗體。也可先將抗體與戊2醛作用，再與酶聯結。兩步法的產物中絕大部分的酶與蛋白質是以1:1的比例結合的，較一步法的酶結合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯的有效率較一步法低。
2、過碘suan鹽氧化法：
本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標記常用此法。反應時，過碘suan 鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質上的氨基形成Schiff氏堿而結合。酶標記物按克分子比例聯結，其最佳比例為：酶/抗體=1-2/1。此法簡便有效，一般認為是HRP最可取的標記方法，但也有人認為所有試劑較為強烈，各批實驗結果不易重演。
按以上方法制備的酶結合物一般都混有未結合物的酶和抗體。理論上，結合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測定，因經過徹底洗滌，游離酶可被除去，并不影響最終的顯色。但游離的抗體則不同，它會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，從而減少了結合到固相上的酶標抗體的量。因此制備的酶結合物應予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應用。硫酸銨鹽析法最為簡便，但效果并不理想，因為此法只能去除留在上清中的游離酶，但相當數量的游離抗體仍與酶結合物一起沉淀而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，高效液相層析法可將制備的結合物清晰地分成三個部分：游離酶、游離抗體和純結合物而取得最佳的分離效果，但費用較貴。
結合物制得后，在用作ELISA試劑前尚需確定其適當的工作濃度。使用過濃的結合物，既不經濟，又可使本底增高；結合物的濃度過低，則又影響檢測的敏感性。所以必須對結合物的濃度予以選擇。最適的工作濃度就是指結合物稀釋至這一濃度時，能維護一個低的本底，并獲得測定的最佳靈敏度，達到最合適的測定條件和測定費用的節省。就酶標抗體本身而言，它的有效工作濃度是指與其相應抗原包被的載體作試驗時，能得到陽性反應的最高稀釋度。例如某一HRP：抗人IgG制劑標明的工作濃度為1:5000，表示該制劑經1:5000稀釋后，在與人IgG包被的固相作ELISA試驗時，將發生陽性反應。但在用于具體的ELISA檢測中，酶標抗體的最適工作濃度受到固相載體的性質、包被抗原或抗體的純度以及整個檢測系統如標本、反應溫度和時間等的影響，因此必須在實際測定條件下進行"滴配"選擇能達到高敏感度的最大稀釋度作為試劑盒中的工作濃度。
二、結合物的保存
酶標抗體中的酶和抗體均為生物活性物質，保存不當，極易失活。高濃度的結合物較為穩定，冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過程中引起活力的減低，而且使用時需經復溶，頗為不便。結合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的冰格中較長時間保存。早期的ELISA試劑盒中的結合物一般均按以上兩種形式供應，配以稀釋液（見3.2.5）臨用時按標明的稀釋度稀釋成工作液�，F在較先進的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在4-8℃保存期可達6個月。由于蛋白質濃度較低，結合物易失活，需加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結合物加硫柳泵，AP結合物可加疊氮鈉），以防止細菌生長。
三、結合物的稀釋液
用于稀釋高濃度的結合物以配成工作液。為避免結合物在反應中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關蛋白質（例如1%牛血清白蛋白），通過競爭以抑制結合物的吸附。一般還加入具有抑制蛋白質吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20，0.05%的濃度較為適宜。在間接測定抗體時，血清標本需稀釋后進行測定，也可應用這種稀釋液。
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