ELISA實(shí)驗(yàn)操作優(yōu)化事項(xiàng)匯總
ELISA實(shí)驗(yàn)是一種常用的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，用于檢測蛋白質(zhì)、抗體、激素等生物分子。優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。一些細(xì)節(jié)操作不當(dāng)就會對試驗(yàn)結(jié)果造成很大偏差，因此我們在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意以下事項(xiàng)：
1. 加樣：
不規(guī)范的移液操作可能帶來0.1％到5％的移液誤差，甚至更高！
（1）移液器定期校準(zhǔn)：選擇密封性好質(zhì)量可靠的吸頭，吸量不準(zhǔn)確，直接影響檢測結(jié)果；
（2）加樣前，溶液充分混勻，垂直懸空加入液體，避免加在孔壁上或產(chǎn)生氣泡；
（3）加樣時(shí)避免液體濺出，如有樣本濺出，應(yīng)用吸水紙輕輕拭干，并做相應(yīng)記錄；
（4）如果移液器漏氣致使加樣量不足，可先吸出（盡量吸凈）后加入需求量，并做好相應(yīng)記錄，若結(jié)果在灰區(qū)，需要復(fù)核檢測；
（5）每次加樣順序一致，尤其底物、終止液順序一致，保證每個(gè)孔顯色時(shí)間相同。
2. 試劑盒使用前室溫平衡：
溫度是ELISA結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素，為使所有樣本在一致的溫度下反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)前務(wù)必將所有的試劑平衡至室溫，包括檢測樣本，避免因溫度的動力學(xué)反應(yīng)差異而導(dǎo)致ELISA檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品的溶解與稀釋，嚴(yán)格按說明書要求進(jìn)行。
ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線是結(jié)果計(jì)算的尺子，標(biāo)準(zhǔn)品是ELISA實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵點(diǎn)。
（1）標(biāo)準(zhǔn)品短暫離心，讓因運(yùn)輸沾到管蓋、管壁的標(biāo)準(zhǔn)品沉到管底。
（2）根據(jù)說明書加入一定體積的蒸餾水（或說明書指定溶液），加水后輕柔渦旋震蕩，室溫靜置混勻。
4. 標(biāo)準(zhǔn)品和樣本做復(fù)孔
為了獲得更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)品和樣本進(jìn)行復(fù)孔檢測。
（1）計(jì)算平均值，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確。
（2）解決實(shí)驗(yàn)中失誤操作造成的跳孔現(xiàn)象。
（3）計(jì)算CV值，對實(shí)驗(yàn)的操作和試劑盒的精密度進(jìn)行評估。
5. 溫育
(1) 溫育時(shí)，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。
(2) 根據(jù)說明書進(jìn)行溫育，并注意避光需求。在進(jìn)行室溫反應(yīng)時(shí)，若環(huán)境溫度與規(guī)定條件偏差較大，可使用恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行有效溫育。
6. 洗滌
（1）手工洗板，拍板時(shí)要垂直，避免交叉污染，用力不能過猛致使液體返濺；
（2）機(jī)器洗板應(yīng)經(jīng)常檢查沖洗頭是否暢通，若被異物堵塞可用纖細(xì)針頭挑出。并注意維護(hù)保養(yǎng)，每天使用后用純化水或去離子水沖洗管路，保持管路潔凈。
（3）洗滌后反應(yīng)板盡量扣干；扣干使用的吸水材料應(yīng)為無塵材質(zhì)，避免污染反應(yīng)孔；扣干后的反應(yīng)板立即加液，不能干板太久影響反應(yīng)。
7. 檢測
（1）酶標(biāo)儀使用前務(wù)必預(yù)熱10~15分鐘，使結(jié)果更穩(wěn)定。
（2）長時(shí)間高濕度容易損壞酶標(biāo)儀濾光片，長時(shí)間不用酶標(biāo)儀時(shí)，需要定期開機(jī)維護(hù)，以保證設(shè)備性能正常。酶標(biāo)儀每年均需定期校驗(yàn)，保證測定結(jié)果準(zhǔn)確。
（3）根據(jù)說明書要求在規(guī)定波長條件下使用酶標(biāo)儀進(jìn)行結(jié)果讀取。有些說明書規(guī)定雙波長測定，該方法可以最大限度的消除指紋、雜質(zhì)及不透光的物質(zhì)對酶標(biāo)儀讀數(shù)帶來的誤差，以保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。
（4）TMB是ELISA檢測中常用的底物，經(jīng)HRP作用后顯藍(lán)色，經(jīng)酸終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長為450nm。
1. 加樣：
不規(guī)范的移液操作可能帶來0.1％到5％的移液誤差，甚至更高！
（1）移液器定期校準(zhǔn)：選擇密封性好質(zhì)量可靠的吸頭，吸量不準(zhǔn)確，直接影響檢測結(jié)果；
（2）加樣前，溶液充分混勻，垂直懸空加入液體，避免加在孔壁上或產(chǎn)生氣泡；
（3）加樣時(shí)避免液體濺出，如有樣本濺出，應(yīng)用吸水紙輕輕拭干，并做相應(yīng)記錄；
（4）如果移液器漏氣致使加樣量不足，可先吸出（盡量吸凈）后加入需求量，并做好相應(yīng)記錄，若結(jié)果在灰區(qū)，需要復(fù)核檢測；
（5）每次加樣順序一致，尤其底物、終止液順序一致，保證每個(gè)孔顯色時(shí)間相同。
2. 試劑盒使用前室溫平衡：
溫度是ELISA結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素，為使所有樣本在一致的溫度下反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)前務(wù)必將所有的試劑平衡至室溫，包括檢測樣本，避免因溫度的動力學(xué)反應(yīng)差異而導(dǎo)致ELISA檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品的溶解與稀釋，嚴(yán)格按說明書要求進(jìn)行。
ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線是結(jié)果計(jì)算的尺子，標(biāo)準(zhǔn)品是ELISA實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵點(diǎn)。
（1）標(biāo)準(zhǔn)品短暫離心，讓因運(yùn)輸沾到管蓋、管壁的標(biāo)準(zhǔn)品沉到管底。
（2）根據(jù)說明書加入一定體積的蒸餾水（或說明書指定溶液），加水后輕柔渦旋震蕩，室溫靜置混勻。
4. 標(biāo)準(zhǔn)品和樣本做復(fù)孔
為了獲得更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)品和樣本進(jìn)行復(fù)孔檢測。
（1）計(jì)算平均值，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確。
（2）解決實(shí)驗(yàn)中失誤操作造成的跳孔現(xiàn)象。
（3）計(jì)算CV值，對實(shí)驗(yàn)的操作和試劑盒的精密度進(jìn)行評估。
5. 溫育
(1) 溫育時(shí)，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。
(2) 根據(jù)說明書進(jìn)行溫育，并注意避光需求。在進(jìn)行室溫反應(yīng)時(shí)，若環(huán)境溫度與規(guī)定條件偏差較大，可使用恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行有效溫育。
6. 洗滌
（1）手工洗板，拍板時(shí)要垂直，避免交叉污染，用力不能過猛致使液體返濺；
（2）機(jī)器洗板應(yīng)經(jīng)常檢查沖洗頭是否暢通，若被異物堵塞可用纖細(xì)針頭挑出。并注意維護(hù)保養(yǎng)，每天使用后用純化水或去離子水沖洗管路，保持管路潔凈。
（3）洗滌后反應(yīng)板盡量扣干；扣干使用的吸水材料應(yīng)為無塵材質(zhì)，避免污染反應(yīng)孔；扣干后的反應(yīng)板立即加液，不能干板太久影響反應(yīng)。
7. 檢測
（1）酶標(biāo)儀使用前務(wù)必預(yù)熱10~15分鐘，使結(jié)果更穩(wěn)定。
（2）長時(shí)間高濕度容易損壞酶標(biāo)儀濾光片，長時(shí)間不用酶標(biāo)儀時(shí)，需要定期開機(jī)維護(hù)，以保證設(shè)備性能正常。酶標(biāo)儀每年均需定期校驗(yàn)，保證測定結(jié)果準(zhǔn)確。
（3）根據(jù)說明書要求在規(guī)定波長條件下使用酶標(biāo)儀進(jìn)行結(jié)果讀取。有些說明書規(guī)定雙波長測定，該方法可以最大限度的消除指紋、雜質(zhì)及不透光的物質(zhì)對酶標(biāo)儀讀數(shù)帶來的誤差，以保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。
（4）TMB是ELISA檢測中常用的底物，經(jīng)HRP作用后顯藍(lán)色，經(jīng)酸終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長為450nm。
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