BCA 蛋白定量檢測試劑盒實驗蛋白濃度測定過程
BCA蛋白定量試劑盒的原理是蛋白質分子中肽鍵結構在堿性條件下將二價銅離子還原為一價銅離子，一價銅離子與BCA分子形成紫色絡合物。此絡合物可用540-590nm波長檢測，并在562nm處有最大的光吸收值。反應物的顏色和蛋白質濃度在一定范圍內具有線性關系，故可以根據吸光度值的大小來測定蛋白的含量。蛋白濃度測定方法取適量未變性的總蛋白溶液，用 BCA 蛋白定量檢測試劑盒測蛋白濃度如下：
1.配制蛋白標準貯備液
取1 mL蛋白標準配制液加入到蛋白標準品（BSA）蛋白標準管中，將25 mg蛋白標準品完全溶解，即得到濃度為25 mg/mL的蛋白標準貯備液。配制成的蛋白標準溶液可-20℃長期保存。
2.配制蛋白標準工作液
取適量25 mg/mL蛋白標準貯備液，用PBS或生理鹽水稀釋50倍，得到終濃度為0.5 mg/mL的蛋白標準工作液。注意稀釋時按照10倍梯度方法稀釋，確保稀釋準確。
3.繪制標準曲線（酶標儀法）
將蛋白標準工作液分別按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理鹽水依次加20、19、18、16、12、8、4、0 μL將上述梯度工作液補足到20 μL。得到蛋白濃度依次為0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的梯度曲線。
4.準備待測樣品
將待測的蛋白樣品進行適當稀釋（可通過預實驗檢測，使樣品蛋白濃度在標準曲線范圍內，確保檢測結果可信），按照每個樣品20 μL的量加到96孔板中。待測樣品與蛋白標準品用相同溶液稀釋。
5.配制BCA顯色工作液
將BCA試劑與硫酸銅溶液按照50:1體積比充分混合均勻，得到BCA顯色工作液。BCA顯色工作液可室溫保存，24 h內使用。每個待測樣品需200 μL，建議按需配制，避免浪費。
6.檢測
向標準曲線樣品孔及待測樣品孔中每孔加入BCA顯色工作液200 μL，充分混勻（可將96孔板放在振蕩器上振蕩30 s），37℃反應30 min后，以標準曲線0號做參比，在562 nm波長下比色測定，記錄各孔吸光度值。（注：也可以在室溫反應2 h，或60℃反應30 min。如果蛋白濃度較低，建議置于60℃反應）
7.計算
以標準曲線中梯度蛋白含量（μg/mL）為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪出標準曲線。根據所測樣品的吸光值，在標準曲線上即可查得相應孔中待測樣品的蛋白濃度（μg/mL），再乘以樣品稀釋倍數即為待測樣品實際蛋白濃度。
提示：
1. BCA法測定蛋白濃度受溫度和時間的影響較大，吸光度值會隨著時間的延長或溫度升高而變化，如果不能精確控制顯色反應的時間和溫度，建議每次測定都需要做標準曲線。
2. 在進行蛋白標準貯備液的配制時，需確保溶解充分。稀釋配制蛋白標準工作液時建議10倍梯度稀釋，不要一次稀釋50倍，以免產生較大誤差。
3. 為保證蛋白的精確定量，樣品的提取和蛋白標準品的稀釋配制最好選用相同的緩沖液，同保證兩者檢測條件一致。如果緩沖液本身就有較高的背景值，建議使用其他的方法測定。
4. 操作時請穿實驗服，并佩戴一次性手套。
1.配制蛋白標準貯備液
取1 mL蛋白標準配制液加入到蛋白標準品（BSA）蛋白標準管中，將25 mg蛋白標準品完全溶解，即得到濃度為25 mg/mL的蛋白標準貯備液。配制成的蛋白標準溶液可-20℃長期保存。
2.配制蛋白標準工作液
取適量25 mg/mL蛋白標準貯備液，用PBS或生理鹽水稀釋50倍，得到終濃度為0.5 mg/mL的蛋白標準工作液。注意稀釋時按照10倍梯度方法稀釋，確保稀釋準確。
3.繪制標準曲線（酶標儀法）
將蛋白標準工作液分別按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理鹽水依次加20、19、18、16、12、8、4、0 μL將上述梯度工作液補足到20 μL。得到蛋白濃度依次為0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的梯度曲線。
4.準備待測樣品
將待測的蛋白樣品進行適當稀釋（可通過預實驗檢測，使樣品蛋白濃度在標準曲線范圍內，確保檢測結果可信），按照每個樣品20 μL的量加到96孔板中。待測樣品與蛋白標準品用相同溶液稀釋。
5.配制BCA顯色工作液
將BCA試劑與硫酸銅溶液按照50:1體積比充分混合均勻，得到BCA顯色工作液。BCA顯色工作液可室溫保存，24 h內使用。每個待測樣品需200 μL，建議按需配制，避免浪費。
6.檢測
向標準曲線樣品孔及待測樣品孔中每孔加入BCA顯色工作液200 μL，充分混勻（可將96孔板放在振蕩器上振蕩30 s），37℃反應30 min后，以標準曲線0號做參比，在562 nm波長下比色測定，記錄各孔吸光度值。（注：也可以在室溫反應2 h，或60℃反應30 min。如果蛋白濃度較低，建議置于60℃反應）
7.計算
以標準曲線中梯度蛋白含量（μg/mL）為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪出標準曲線。根據所測樣品的吸光值，在標準曲線上即可查得相應孔中待測樣品的蛋白濃度（μg/mL），再乘以樣品稀釋倍數即為待測樣品實際蛋白濃度。
提示：
1. BCA法測定蛋白濃度受溫度和時間的影響較大，吸光度值會隨著時間的延長或溫度升高而變化，如果不能精確控制顯色反應的時間和溫度，建議每次測定都需要做標準曲線。
2. 在進行蛋白標準貯備液的配制時，需確保溶解充分。稀釋配制蛋白標準工作液時建議10倍梯度稀釋，不要一次稀釋50倍，以免產生較大誤差。
3. 為保證蛋白的精確定量，樣品的提取和蛋白標準品的稀釋配制最好選用相同的緩沖液，同保證兩者檢測條件一致。如果緩沖液本身就有較高的背景值，建議使用其他的方法測定。
4. 操作時請穿實驗服，并佩戴一次性手套。
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