PCR實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備及循環(huán)步驟詳解
一、PCR實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備
在開始PCR實(shí)驗(yàn)之前，必須準(zhǔn)備好DNA模板（基因組DNA或逆轉(zhuǎn)錄制備的cDNA）、特異性引物（自己設(shè)計(jì)或用軟件設(shè)計(jì)），并選擇合適的商業(yè)酶（選擇符合您實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡拿?
1.DNA聚合酶。有許多商業(yè) DNA 聚合酶，它們具有不同的特性。一般分為兩類：高保真聚合酶和普通Taq聚合酶。如果您想對(duì)沒有任何突變的特定 DNA 片段進(jìn)行 PCR，請(qǐng)選擇高保真聚合酶。如果只是想檢測(cè)特定序列的存在，就選擇普通的Taq聚合酶。如果要對(duì)T-vector連接的片段進(jìn)行PCR，要注意，因?yàn)榇蠖鄶?shù)高保真聚合酶的產(chǎn)物都沒有A-tailing，所以應(yīng)該選擇普通的Taq聚合酶或在PCR實(shí)驗(yàn)后添加A-tailing。
2.引物的特異性影響 PCR 成功的概率，良好的引物設(shè)計(jì)對(duì) PCR 擴(kuò)增的成功至關(guān)重要。當(dāng)您開始設(shè)計(jì)引物時(shí)，應(yīng)仔細(xì)考慮以下幾個(gè)原則：
①引物的長(zhǎng)度。PCR引物一般在18-22bp左右。這對(duì)于引物特異性和在退火溫度下的結(jié)合來說是足夠長(zhǎng)的。
②熔化溫度(Tm)。Tm 定義為在此溫度下，DNA 雙鏈體的一半將解離成單鏈 DNA。52-58C 范圍內(nèi)的引物 Tm 是最佳的。
③GC 含量。最佳 GC 含量應(yīng)為 40-60%。
④許多軟件可用于引物設(shè)計(jì)，例如primer5和Oligo。這些軟件推薦的引物通常可以滿足我們的需求。
二、實(shí)驗(yàn)步驟：
根據(jù)PCR使用說明進(jìn)行試劑混合預(yù)配，并設(shè)置 PCR 循環(huán)。
簡(jiǎn)而言之，PCR需要經(jīng)過以下循環(huán)：
1.初始化步驟。這僅對(duì)熱啟動(dòng) PCR 必不可少。此步驟將溶液加熱至 94-98°C，以激活 DNA 聚合酶。該步驟的時(shí)間取決于所使用的聚合酶。
2.變性步驟。DNA是雙鏈分子，DNA擴(kuò)增需要引物與單鏈DNA模板相互作用。在此步驟中，將反應(yīng)混合物加熱至 94-98°C 并保持 20-30 秒，以破壞兩條鏈之間的氫鍵并生成單鏈 DNA 分子。此時(shí)進(jìn)入 PCR 循環(huán)。
3.退火步驟。變性后，反應(yīng)混合物中的 DNA 模板是單鏈的。由于引物與DNA模板互補(bǔ)，當(dāng)反應(yīng)溫度降低到50-65℃時(shí)，引物會(huì)與模板序列匹配，互補(bǔ)堿基之間形成氫鍵。退火溫度取決于所用引物的Tm，一般比引物Tm低3-5℃左右。該步驟將持續(xù)約 20-40 秒以完全退火，然后聚合酶將定位到引物-模板雜交體以開始 DNA 組裝。
4.伸長(zhǎng)步驟。在此步驟中，DNA 聚合酶開始合成 DNA，因此溫度應(yīng)為 DNA 聚合酶的最適溫度。一般選擇 72°C，但有些酶在 68°C 時(shí)效果更好。這一步與體內(nèi)DNA復(fù)制非常相似，DNA聚合酶將dNTPs添加到引物中，以5'到3'方向與模板互補(bǔ)，最終產(chǎn)生新的雙鏈DNA片段。延伸時(shí)間取決于目標(biāo) DNA 片段的長(zhǎng)度和 DNA 聚合酶的能力。一般來說，DNA 聚合酶每 60 秒產(chǎn)生一千個(gè)堿基。
5. 2~4步稱為一個(gè)循環(huán)，每循環(huán)一次，目標(biāo)片段量翻倍。一個(gè) PCR 過程使用 30-35 個(gè)循環(huán)。在 PCR 循環(huán)的早期，PCR 產(chǎn)物以指數(shù)速率積累，而在 PCR 循環(huán)的后期，隨著 dNTPs、引物的減少和 DNA 聚合酶在變性溫度下的失活，反應(yīng)減慢，PCR 速率逐漸下降。
6.最終伸長(zhǎng)率。30-35個(gè)循環(huán)結(jié)束后，在68-74℃的溫度下最終延伸約5-10分鐘，以充分延伸剩余的單鏈DNA。
7.貯存。最終產(chǎn)品可以在 PCR 機(jī)器中維持溫度在 4-10°C。
在開始PCR實(shí)驗(yàn)之前，必須準(zhǔn)備好DNA模板（基因組DNA或逆轉(zhuǎn)錄制備的cDNA）、特異性引物（自己設(shè)計(jì)或用軟件設(shè)計(jì)），并選擇合適的商業(yè)酶（選擇符合您實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡拿?
1.DNA聚合酶。有許多商業(yè) DNA 聚合酶，它們具有不同的特性。一般分為兩類：高保真聚合酶和普通Taq聚合酶。如果您想對(duì)沒有任何突變的特定 DNA 片段進(jìn)行 PCR，請(qǐng)選擇高保真聚合酶。如果只是想檢測(cè)特定序列的存在，就選擇普通的Taq聚合酶。如果要對(duì)T-vector連接的片段進(jìn)行PCR，要注意，因?yàn)榇蠖鄶?shù)高保真聚合酶的產(chǎn)物都沒有A-tailing，所以應(yīng)該選擇普通的Taq聚合酶或在PCR實(shí)驗(yàn)后添加A-tailing。
2.引物的特異性影響 PCR 成功的概率，良好的引物設(shè)計(jì)對(duì) PCR 擴(kuò)增的成功至關(guān)重要。當(dāng)您開始設(shè)計(jì)引物時(shí)，應(yīng)仔細(xì)考慮以下幾個(gè)原則：
①引物的長(zhǎng)度。PCR引物一般在18-22bp左右。這對(duì)于引物特異性和在退火溫度下的結(jié)合來說是足夠長(zhǎng)的。
②熔化溫度(Tm)。Tm 定義為在此溫度下，DNA 雙鏈體的一半將解離成單鏈 DNA。52-58C 范圍內(nèi)的引物 Tm 是最佳的。
③GC 含量。最佳 GC 含量應(yīng)為 40-60%。
④許多軟件可用于引物設(shè)計(jì)，例如primer5和Oligo。這些軟件推薦的引物通常可以滿足我們的需求。
二、實(shí)驗(yàn)步驟：
根據(jù)PCR使用說明進(jìn)行試劑混合預(yù)配，并設(shè)置 PCR 循環(huán)。
簡(jiǎn)而言之，PCR需要經(jīng)過以下循環(huán)：
1.初始化步驟。這僅對(duì)熱啟動(dòng) PCR 必不可少。此步驟將溶液加熱至 94-98°C，以激活 DNA 聚合酶。該步驟的時(shí)間取決于所使用的聚合酶。
2.變性步驟。DNA是雙鏈分子，DNA擴(kuò)增需要引物與單鏈DNA模板相互作用。在此步驟中，將反應(yīng)混合物加熱至 94-98°C 并保持 20-30 秒，以破壞兩條鏈之間的氫鍵并生成單鏈 DNA 分子。此時(shí)進(jìn)入 PCR 循環(huán)。
3.退火步驟。變性后，反應(yīng)混合物中的 DNA 模板是單鏈的。由于引物與DNA模板互補(bǔ)，當(dāng)反應(yīng)溫度降低到50-65℃時(shí)，引物會(huì)與模板序列匹配，互補(bǔ)堿基之間形成氫鍵。退火溫度取決于所用引物的Tm，一般比引物Tm低3-5℃左右。該步驟將持續(xù)約 20-40 秒以完全退火，然后聚合酶將定位到引物-模板雜交體以開始 DNA 組裝。
4.伸長(zhǎng)步驟。在此步驟中，DNA 聚合酶開始合成 DNA，因此溫度應(yīng)為 DNA 聚合酶的最適溫度。一般選擇 72°C，但有些酶在 68°C 時(shí)效果更好。這一步與體內(nèi)DNA復(fù)制非常相似，DNA聚合酶將dNTPs添加到引物中，以5'到3'方向與模板互補(bǔ)，最終產(chǎn)生新的雙鏈DNA片段。延伸時(shí)間取決于目標(biāo) DNA 片段的長(zhǎng)度和 DNA 聚合酶的能力。一般來說，DNA 聚合酶每 60 秒產(chǎn)生一千個(gè)堿基。
5. 2~4步稱為一個(gè)循環(huán)，每循環(huán)一次，目標(biāo)片段量翻倍。一個(gè) PCR 過程使用 30-35 個(gè)循環(huán)。在 PCR 循環(huán)的早期，PCR 產(chǎn)物以指數(shù)速率積累，而在 PCR 循環(huán)的后期，隨著 dNTPs、引物的減少和 DNA 聚合酶在變性溫度下的失活，反應(yīng)減慢，PCR 速率逐漸下降。
6.最終伸長(zhǎng)率。30-35個(gè)循環(huán)結(jié)束后，在68-74℃的溫度下最終延伸約5-10分鐘，以充分延伸剩余的單鏈DNA。
7.貯存。最終產(chǎn)品可以在 PCR 機(jī)器中維持溫度在 4-10°C。
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