1.引物最好在模板cDNA 的保守區內設計。

      DNA 序列的保守區是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI 上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區。

2.引物長度一般在15~30 堿基之間。

      引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應。

3.引物GC 含量在40%~60%之間，Tm 值最好接近72℃。

      GC 含量（composition）過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC 含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm 值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm 值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm 值，則有效引物的Tm 為55~80℃，其Tm 值最好接近72℃以使復性條件最佳。

4.引物3′端要避開密碼子的第3 位。

      如擴增編碼區域，引物3′端不要終止于密碼子的第3 位，因密碼子的第3 位易發生簡并，會影響擴增的特異性與效率。

5.引物3′端不能選擇A，最好選擇T。

      引物3′端錯配時，不同堿基引發效率存在著很大的差異，當末位的堿基為A 時，即使在錯配的情況下，也能有引發鏈的合成，而當末位鏈為T 時，錯配的引發效率大大降低，G、C 錯配的引發效率介于A、T 之間，所以3′端最好選擇T。

6. 堿基要隨機分布。

      引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發（False

priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3 個連續的G 或C，因這樣會使引物在GC 富集序列區錯誤引發。

7. 引物自身及引物之間不應存在互補序列。

      引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾結構（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續4 個堿基的互補。

      兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3′ 端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer 與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續4 個堿基的互補。

      引物二聚體及發夾結構如果不可避免的話，應盡量使其△G 值不要過高（應小于4.5kcalmol）。否則易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行。

8. 引物5′ 端和中間△G 值應該相對較高，而3′ 端△G 值較低。

      △G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性，△G 值越大，則雙鏈越穩定。應當選用5′ 端和中間△G 值相對較高，而3′ 端△G 值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3′ 端的△G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA 聚合反應。（不同位置的△G 值可以用Oligo 6 軟件進行分析）

9.引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。

      引物的5′ 端決定著PCR 產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′ 端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA 序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。

      引物的延伸是從3′ 端開始的，不能進行任何修飾。3′ 端也不能有形成任何二級結構可能。

10. 擴增產物的單鏈不能形成二級結構。

      某些引物無效的主要原因是擴增產物單鏈二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。用有關軟件（比如RNAstructure）可以預測估計mRNA 的穩定二級結構，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△G°）小于58.6l kJmol 時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP 取代dGTP 對擴增的成功是有幫助的。

11. 引物應具有特異性。

      引物設計完成以后，應對其進行BLAST 檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。

值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC 含量偏高或偏低，導致找

不到各種指標都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。