ELISA樣本制備及注意事項

一、血清的采集、處理和保存

1、真空采血針采集新鮮血液，加入無菌試管中；

2、采血后室溫靜置1小時；

3、將采集血液用離心機4℃，2500rpm離心10min；

4、取上清。分裝凍存備用：

2-8℃下，可放置保存24-48小時；

-20℃下，可放置保存1個月；

-80℃下，可放置保存6個月；

5、根據你的實驗需要，取適量上清夜進行各種ELISA測定。

大部分ELISA檢測均以血清為標本。血清標本可按常規方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特異顯色。此外還應避免細菌污染，因為菌體中可能含有含有內源性HRP，也會產生假陽性反應。血清標本宜在新鮮時檢測。如在冰箱中保存過久，其中的可發生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。

二、ELISA 實驗中血漿的采集、處理和保存

1、真空采血針采集2ml 新鮮血液，加入無菌試管中；

2、按 1:9加入抗凝劑（EDTA、草酸鈉、肝素、枸櫞酸鈉），30分鐘內于冰上分離血漿以減少血小板的污染；（也可以直接用抗凝管采集）；

3、將采集血液用離心機4℃，2500rpm離心5min；

4、取上清。分裝凍存備用，

2-8℃下，可放置保存24-48小時；

-20℃下，可放置保存1個月；

-80℃下，可放置保存6個月；

5、根據你的實驗需要，取適量上清夜進行各種ELISA測定。請注意指標說明書上對于抗凝血劑是否有特殊要求，建議使用EDTA。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標本需借助于抗凝劑EDTA，抗凝不完全的標本因纖維蛋白原干擾而造成假陽性。

三、ELISA 實驗中尿液的采集、處理和保存

1、采集尿液樣本500ul，加入無菌試管中；

2、將采集血液用離心機4℃，2500rpm離心10min；

3、取上清。分裝凍存備用：

2-8℃下，可放置保存24-48小時；

-20℃下，可放置保存1個月；

-80℃下，可放置保存6個月；

4、根據你的實驗需要，取適量上清夜進行各種ELISA測定。

四、ELISA 實驗中腦脊液的采集、處理和保存

1、采集腦脊液樣本，加入無菌試管中；

2、將采集的腦脊液用離心機4℃，2500rpm 離心10min；

3、取上清。分裝凍存備用：

2-8℃下，可放置保存24-48小時；

-20℃下，可放置保存1個月；

-80℃下，可放置保存6個月；

4、根據你的實驗需要，取適量上清夜進行各種ELISA 測定。

五、ELISA 實驗中細胞上清液的采集、處理和保存

1、采集細胞培養上清液，加入無菌試管中；

2、將采集的細胞上清液用離心機4℃，2500rpm離心10min；

3、取上清。分裝凍存備用：

2-8℃下，可放置保存24-48小時；

-20℃下，可放置保存1個月；

-70℃下，可放置保存6個月；

4、根據你的實驗需要，取適量上清夜進行各種ELISA 測定。

六、ELISA 實驗中肺泡灌洗液的采集、處理和保存

1、10%水合氯醛溶液，腹腔麻醉；

2、打開腹腔，另取10ml注射器行下腔靜脈采血，盡可能將血放盡；

3、在冰面上對左肺進行肺灌洗。取37℃生理鹽水5ml，分三次灌洗：2ml、1.5ml、1.5ml灌，。回收率在70%以上；

4、將采集的肺泡灌洗液用離心機4℃，2500rpm離心10min；

5、取上清。分裝凍存備用：

2-8℃下，可放置保存24-48小時；

-20℃下，可放置保存1個月；

-70℃下，可放置保存6個月；

6、根據你的實驗需要，取適量上清夜進行各種ELISA 測定。

七、ELISA 實驗中關節滑液的采集、處理和保存

1、口腔關節：患者取坐位，常規消毒后，作皮下及關節后區局部浸潤麻醉。然后囑患者大張口，采用裝有2ml生理鹽水的注射器（5號針頭）作關節上腔穿刺，髁后進針，針尖方向斜向前、內、上，抵達關節結節后斜面后稍后退，回抽如發現有淡黃色液體，即表明已進入關節上腔，注入2ml生理鹽水，反復注入、回抽五次；

2、膝骨關節滑液：無菌穿刺取得關節液3ml；

3、將采集的關節滑液用離心機4℃，1500rpm離心15min；

4、取上清。分裝凍存備用：

2-8℃下，可放置保存24-48小時；

-20℃下，可放置保存1個月；

-70℃下，可放置保存6個月；

5、根據你的實驗需要，取適量上清夜進行各種ELISA 測定。

八、ELISA 實驗中細胞的采集、處理和保存

1、細胞板貼壁細胞直接裂解：細胞棄培養上清，PBS清洗三遍，加適量裂解液重懸（過量會降低濃度，很重要），超聲破碎或用槍吹打100下；

2、細胞團塊裂解：細胞團塊加1ml PBS重懸（注意不要過于劇烈造成細胞破裂），1000rpm離心5分鐘，棄上清，重復3次，加適量裂解液重懸（過量會降低濃度，很重要），超聲破碎或用槍吹打100下；

3、懸浮細胞裂解：轉移至EP管，1000rpm離心5分鐘，棄上清，PBS洗三遍，加適量裂解液重懸（過量會降低濃度，很重要），超聲破碎或用槍吹打100下；

4、冰上裂解30mins，用離心機4℃，12000rpm離心10mins；

5、取上清。分裝凍存備用：

2-8℃下，可放置保存24-48小時；

-20℃下，可放置保存1個月；

-70℃下，可放置保存6個月；

6、根據你的實驗需要，取適量上清夜進行各種ELISA 測定。

根據要檢測的指標，必要時需要加入蛋白酶抑制劑。如果處理后馬上檢測，也可以不加這些抑制劑直接裂解，裂解液的量根據不同細胞系會有不同，原則為裂解后總蛋白濃度不低于0.5mg/ml。

九、ELISA 實驗中易碎軟組織（腦、肝、腎）的采集、處理和保存

1、稱取組織塊（50mg-100mg），按質量體積比1：9加入裂解液（例：50mg組織濕重加入450ul裂解液）；

2、冰水浴中用眼科剪剪碎組織塊；

3、冰水浴中電動勻漿機或超聲破碎；

4、用離心機4℃，12000rpm離心15mins；

5、取上清。分裝凍存備用：

2-8℃下，可放置保存24-48小時；

-20℃下，可放置保存1個月；

-70℃下，可放置保存6個月；

6、根據你的實驗需要，取適量上清夜進行各種ELISA 測定。

根據要檢測的指標，必要時需要加入蛋白酶抑制劑。如果處理后馬上檢測，也可以不加這些抑制劑直接裂解。

十、ELISA 實驗中心肌、肌肉組織的采集、處理和保存

1、稱取組織塊（50mg-100mg），按質量體積比1：9加入裂解液（例：50mg組織濕重加入450ul裂解液）；

2、冰水浴中用眼科剪剪碎組織塊；

3、冰水浴中研磨棒研磨或超聲破碎；

4、用離心機4℃，12000rpm離心15mins；

5、取上清。分裝凍存備用：

2-8℃下，可放置保存24-48小時；

-20℃下，可放置保存1個月；

-70℃下，可放置保存6個月；

6、根據你的實驗需要，取適量上清夜進行各種ELISA 測定。

心肌、肌肉組織無法用勻漿機勻漿，組織塊會絞入鉆頭形成團塊，無法被勻漿機刀頭切碎，需用研磨或超聲才能充分破碎。根據要檢測的指標，必要時需要加入蛋白酶抑制劑。如果處理后馬上檢測，也可以不加這些抑制劑直接裂解。

十一、ELISA 實驗中上皮組織（皮膚、膀胱、腸）及人或大鼠眼角膜的采集、處理和保存

1、稱取組織塊（50mg-100mg），按質量體積比1：9加入裂解液（例：50mg組織濕重加入450ul裂解液）；

2、冰水浴中用眼科剪剪碎組織塊；

3、冰水浴中研磨棒研磨或超聲破碎；

4、用離心機4℃，12000rpm離心15mins；

5、取上清。分裝凍存備用：

2-8℃下，可放置保存24-48小時；

-20℃下，可放置保存1個月；

-70℃下，可放置保存6個月；

6、根據你的實驗需要，取適量上清夜進行各種ELISA 測定。

上皮組織韌性較強，較難剪碎，需要增加組織破碎時間才能充分破碎。根據要檢測的指標，必要時需要加入蛋白酶抑制劑。如果處理后馬上檢測，也可以不加這些抑制劑直接裂解。

十二、ELISA 實驗中小顆粒組織（神經節、小鼠眼角膜、鞏膜）的采集、處理和保存

1、加入200ul裂解液；

2、冰水浴中用顯微剪剪碎組織塊；

3、冰水浴中研磨棒研磨或超聲破碎；

4、用離心機4℃，12000rpm離心15mins；

5、取上清。分裝凍存備用：

2-8℃下，可放置保存24-48小時；

-20℃下，可放置保存1個月；

-70℃下，可放置保存6個月；

6、根據你的實驗需要，取適量上清夜進行各種ELISA 測定。

小顆粒組織量比較小，會有靶標蛋白量低于檢測限度的風險，注意組織勻漿離心后上清總蛋白濃度需大于0.5mg/ml。根據要檢測的指標，必要時需要加入蛋白酶抑制劑。如果處理后馬上檢測，也可以不加這些抑制劑直接裂解。