非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的一種急性、出血性、高傳染性的豬疾病。迄今為止，仍然沒有廣泛有效的疫苗和治療方式用于應對非洲豬瘟，通常依靠快速診斷和撲殺感染豬等手段對疫情進行有效控制。

      目前，對于非洲豬瘟的診斷主要依賴于PCR技術，該技術依賴于儀器設備和專業操作人員，只能在實驗室中進行，無法滿足現場診斷的需求。等溫擴增技術，如重組酶聚合酶擴增（RPA）、滾環擴增（RCA）等，具有高效、簡便易行等優勢，但其靈敏度有限，難以單獨用于分子診斷。通過與CRISPR-Cas系統聯用，靈敏度顯著提高，可增加分子診斷的準確性。然而，目前常用的單模式熒光檢測法或比色檢測法易受到環境干擾，造成檢測結果的不準確。

該論文首次構建了基于RPA-CRISPR/Cas12a系統的非洲豬瘟病毒（ASFV）比色-熒光雙模式檢測策略，通過構建新型磁珠-酶報告系統，結合RPA-CRISPR/Cas12a技術，實現了對ASFV基因的比色-熒光雙模式精準檢測。

該方法能實現對單拷貝病毒基因組檢測，可用于便攜式可視化診斷，且在臨床樣本應用中展現了良好的檢測性能，為病毒感染的快速、精準診斷提供了有力工具。

超高靈敏CRISPR-Cas12a分子診斷傳感器構建用于非洲豬瘟病毒感染快速篩查

      本研究開發了一種結合RPA、CRISPR/Cas12a和磁珠-酶新型報告系統，用于ASFV基因的快速精準診斷的方法。如圖1所示，biotin-ssDNA-azide與DBCO修飾的堿性磷酸酶（ALP）通過點擊化學反應合成biotin-ssDNA-ALP，biotin-ssDNA-ALP與鏈霉親和素修飾的磁珠（SA-MB）結合獲得MB-ssDNA-ALP報告系統。用RPA擴增ASFV基因序列，獲得擴增子，擴增子與Cas12a-crRNA復合物結合，激活Cas12a反式切割活性，切割MB-ssDNA-ALP上的ssDNA，釋放ALP；ALP催化pNPP水解生成pNP，引起比色信號變化，再加入量子點作為熒光報告子，實現比色和熒光的雙模式信號輸出。

圖1:探針構建及ASFV檢測原理圖

     
biotin-ssDNA-azide與DBCO-ALP通過點擊化學反應獲得biotin-ssDNA-ALP，biotin-ssDNA-ALP與SA-MB偶聯獲得MB-ssDNA-ALP報告子。RPA擴增ASFV基因，擴增子激活Cas12a-crRNA復合物，Cas12a非特異性切割biotin-ssDNA-ALP報告子，釋放ALP；ALP水解pNPP，生成黃色pNP，加入藍色QDs后，在內濾效應作用下，藍色QDs熒光被猝滅。

在該研究中，團隊首先合成、表征了biotin-ssDNA-ALP，并驗證了biotin-ssDNA-N3與DBCO修飾ALP的偶聯以及MB-ssDNA-ALP探針的合成。然后，考察了RPA擴增ASFV基因的能力。以高度保守的ASFV B646L基因為靶標，設計了三對RPA引物，通過瓊脂糖凝膠電泳實驗驗證了三對引物都可高效擴增ASFV基因。接著，驗證了CRISPR-Cas12a靶向剪切ASFV基因的能力。設計靶向三個RPA擴增子序列的crRNA，利用瓊脂糖凝膠電泳驗證了Cas12a被激活并切割RPA擴增子。最后，結合合成的MB-ssDNA-ALP探針、RPA-CRISPR/Cas12a系統以及藍色CdZnSe QDs，實現了對ASFV基因的比色-熒光雙模式精準檢測，靈敏度達20 copies/mL，可視化檢測104 copies/mL（圖 2A-2D）。

      磁分離技術的使用可有效降低背景信號，實現高信噪比檢測。對比發現本研究開發的檢測方法靈敏度高于qPCR，且具有良好的特異性，探針不與其它豬疾病相關病毒產生交叉反應。同時，還探究了該方法在實際樣本中的檢測能力，對12份豬血真實樣本進行了分析，結果顯示該檢測方法具有100%的準確度（圖2E和2F）。本方法結合熒光法的高靈敏度和比色法的易讀性，具有良好的靈敏度、便攜性和特異性，為病毒感染的快速、精準診斷提供了有效工具。

圖2 比色-熒光雙模式檢測ASFV基因。
（A）不同濃度ASFV基因下，pNP的紫外光譜。
（B）400 nm處吸光度與ASFV基因濃度的對數值之間的線性關系。
（C）不同濃度ASFV基因下，CdZnSe QDs的熒光光譜。
（D）熒光強度變化與ASFV基因濃度的對數值之間的線性關系。
比色（E）和熒光（F）檢測方法用于臨床樣本的分析結果。
可視化檢測結果均列于圖片上方。

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