小分子不同靶點篩選方案的技術路線、優勢及經典案例分享
小分子篩選下游靶點蛋白是藥物發現、疾病機制研究以及生物學功能探究中的關鍵環節。小分子藥物結合靶點蛋白的發現，不僅能幫助理解疾病的分子機制，也能指導藥物的設計與優化，從而提高藥效、減少副作用，并推動精準醫療的發展。達吉特針對此提供了兩類不同的靶點篩選方案，方案一：基于修飾的策略，引入標記基團，提高篩選效率，便于后續分析，適用于可以進行生物素或炔基標記的小分子；方案二：非修飾策略，適用于不能夠進行化學修飾的小分子，保持小分子原貌，技術難度較低，直接反應小分子與靶點的相互作用。從小分子標記到小分子靶點篩選再到小分子靶點蛋白的驗證，達吉特具備全鏈條服務體系，幫助研究人員在多個階段有效篩選和驗證潛在的藥物靶點。
丨 方案一：基于修飾的策略
No.1 20K人類蛋白組芯片
芯片上有超過2萬種人類全長蛋白質，覆蓋81%的人類基因組ORF區，是目前世界上通量最高的蛋白質芯片。將帶有生物素標記的小分子與20K芯片共同孵育，再引入帶有CY3或CY5熒光的鏈霉親和素，通過檢測芯片上的熒光信號，即可確定小分子的直接結合靶蛋白。20K芯片不僅能夠篩選出與小分子直接結合的靶點蛋白，還能解決傳統方法中由于蛋白豐度低而難以捕捉的藥-靶結合問題，更因其具備豐富的蛋白種類，單次實驗即可產出多項科研成果，具有極高性價比。
丨 技術路線
Step1：將小分子標記上生物素
Step2：標記了生物素的小分子和芯片共同孵育
Step3：加入帶有熒光的鏈酶親和素
Step4：固定波長下進行熒光檢測，讀取芯片上的熒光信號值
丨 芯片優勢
1. 篩選直接結合的靶點蛋白，假陽性率較低
2. 無需克隆構建、細胞培養和轉染實驗
3. 芯片覆蓋多種蛋白類型，結合蛋白范圍更廣，性價比較高
4. 采用酵母表達純化，蛋白豐度高，可檢測到微弱蛋白互作現象
經典案例：20K芯片確定雷公藤紅素的多靶點與多效性
溫州醫科大學藥學院梁廣教授團隊使用生物素標記雷公藤紅素，利用一次20K人類蛋白組芯片實驗的結果尋找到其多個直接作用靶點蛋白，發現雷公藤紅素能夠直接靶向信號轉導及轉錄激活蛋白3 （STAT3）和過氧化還原蛋白2（Prdx2）。確定雷公藤紅素的直接靶點蛋白后，通過功能性實驗證明了雷公藤紅素在治療胃癌和保護心臟方面發揮一定的作用。
No.2 GPCR膜蛋白芯片
G蛋白偶聯受體（GPCR）是細胞表面最大、最通用的受體家族之一，約34%的已上市藥物是與GPCR功能相關的。GPCR蛋白一般具有5-7次跨膜結構，脫離磷脂雙分子層的支持，GPCR蛋白很難保持活性構象。目前研究GPCR最常用的方法是在轉染的哺乳動物細胞系中過表達，然而轉染的細胞也含有內源性受體，這給實驗結果的解釋帶來了挑戰。
達吉特推出的GPCR膜蛋白芯片，在單純皰疹病毒（HSV-1）上表達GPCR，經過宿主細胞的復制后，將病毒粒子純化出來點制在三維立體修飾的芯片片基上，GPCR蛋白在病毒磷脂雙分子層的支持下可保持完整的活性結構。這種方法消除了使用傳統方法研究GPCR蛋白時發現的內源性細胞受體的問題，避免了基于細胞的結合分析的限制，并且能夠展現出更清晰的數據。目前該芯片上共包含428種常見藥靶膜蛋白，其中GPCR蛋白292種，約占據非嗅覺GPCR全種類的72%。將帶有生物素標記的小分子與GPCR膜蛋白芯片共同孵育，再引入帶有CY3或CY5熒光的鏈霉親和素，通過檢測芯片上的熒光信號，即可確定小分子的直接結合膜蛋白。
GPCR膜蛋白芯片上的種類詳情：
丨 GPCR膜蛋白芯片優勢
1. 篩選直接結合的膜蛋白靶點，假陽性率較低
2. 采用病毒表達膜蛋白，避免了細胞系表達的內源性蛋白質干擾，保留了GPCR膜蛋白的天然構象與生物學活性
3. 芯片覆蓋多種GPCR蛋白和RTK激酶，結合蛋白范圍更廣，性價比高
4. 熒光檢測結合反應，高靈敏度檢測
經典案例：強啡肽結合膜蛋白篩選
強啡肽（ Dynorphin A ）是一種抑制性神經肽，在鎮痛等研究中常用，但直接靶點仍不清楚。本研究利用GPCR膜蛋白芯片篩選，發現強啡肽可以與3種膜蛋白結合，其中結合強度最強的是一種叫作OPRD1的阿片受體A類GPCR蛋白，非常符合研究預期。
No.3 ABPP基于炔基標記的點擊化學技術
ABPP（Activity-Based Protein Profiling）是在點擊化學和LC-MS質譜基礎上發展起來的小分子化合物靶點蛋白的篩選技術。將小分子進行炔基標記后處理細胞，通過簡便高效的點擊化學反應，將結合上靶點蛋白的炔基小分子連接到帶有疊氮的磁珠上，通過磁珠離心獲取小分子靶向結合的靶點蛋白。進一步，通過LC-MS分析出小分子的潛在靶點蛋白。
丨 技術路線
Step1：小分子進行炔基標記
Step2：標記了炔基的小分子與細胞共孵育
Step3：預實驗，使用熒光標記的疊氮與細胞裂解液共同孵育，通過熒光凝膠以及熒光成像系統檢測反應條帶
Step4：正式實驗，使用生物素標記的疊氮與細胞裂解液共同孵育
Step5：利用鏈霉親和素磁珠釣出靶蛋白
Step6：質譜分析，鑒定靶蛋白 
丨 特點優勢
1. 炔基修飾對小分子的活性和結構影響小，幾乎不干擾小分子原本的生物活性
2. 炔基標記的小分子可在活細胞水平上進行靶點篩選
3. 研究方向明確，篩選到的是與研究方向相關的靶點蛋白
4. 擁有完整的小分子炔基標記體系
經典案例：ABPP篩選天然產物野馬追內酯B抗癌靶點
南方科技大學第一附屬醫院聯合中國醫學科學院研究團隊利用炔基標記天然產物野馬追內酯B（EB），合成了保留原有抗三陰乳腺癌活性的小分子探針，并利用ABPP技術篩選EB的靶點蛋白。實驗結果顯示，EB通過靶向BCAT1介導的BCAA代謝抑制SHOC2/RAS/ERK激活，最終抑制癌細胞增殖并促進細胞凋亡。本研究發現了三陰乳腺癌的治療新靶標，為其臨床新藥開發提供了新的思路。
No.4 Pull down+MS技術
小分子藥靶篩選的Pull down實驗是一種有效的篩選藥物與潛在靶蛋白之間相互作用的體外技術。利用生物分子之間的親和力原理，將生物素標記的小分子化合物固定在鏈霉親和素的磁珠上，與蛋白裂解液進行孵育，孵育結束后與小分子結合的蛋白可以通過質譜檢測，將下游的靶點蛋白鑒定出來。該方法簡單易行，操作方便，在藥靶篩選方面已得到廣泛的應用。
丨 技術路線
Step1：小分子進行生物素標記
Step2：標記了生物素的小分子與鏈霉親和素磁珠共同孵育，將小分子固定到磁珠上，形成小分子探針
Step3：將小分子探針與細胞裂解液共同孵育
Step3：離心、洗脫，獲取靶蛋白
Step4：質譜分析，對靶蛋白進行鑒定
丨 特點優勢
1. 不受結合原理限制，適用范圍廣
2. 研究方向明確，篩選到的是與研究方向相關的靶點蛋白
3. 鑒定到的靶點蛋白數量較多
4. 可檢測到細胞內與小分子結合的靶點蛋白及其互作網絡譜
經典案例：Pull down +MS篩選蘇木酮A的抗炎靶點
2017年7月北京大學屠鵬飛教授團隊利用Biotin-SA探針進行Pull down+MS實驗“垂釣”蘇木酮（SA）的潛在靶點蛋白，發現肌苷單磷酸脫氫酶2（IMPDH2）是SA的關鍵作用靶點，通過SPR和CETSA實驗進一步驗證了SA與IMPDH2的直接作用關系，后續通過功能性實驗證明了蘇木酮A在抗神經炎癥方面的作用功效。
No.5 SPIDER基于鄰近標記技術的膜蛋白靶點篩選技術
SPIDER技術的原理基于結核分枝桿菌類泛素蛋白酶體系統中底物Pup分子在體外能夠招募PafA連接酶發揮鄰近標記作用。將小分子進行生物素標記后處理活細胞，當小分子與靶蛋白（Target）發生相互作用時，會同時與偶聯了生物素的SAm-PupE靠近。在PafA酶的催化作用下，PupE的C末端會與Target蛋白表面的賴氨酸殘基共價相連，形成類泛素連接反應，進一步，通過LC-MS分析出小分子的潛在靶點蛋白。該過程將小分子與蛋白質之間的非共價結合相互作用轉換為SAm-PupE與靶蛋白的共價連接，從而能夠穩定地用于后續靶蛋白的富集、鑒定和分析。
丨 技術路線
Step1：小分子進行生物素標記
Step2：標記了生物素的小分子與活細胞共同反應
Step3：引入帶有PupE的鏈酶親和素和PafA酶
Step3：利用生物素磁珠釣取靶蛋白
Step4：質譜分析，對靶蛋白進行鑒定
丨 特點優勢
1. 在活細胞水平上進行靶點篩選，能夠保證膜蛋白的活性；
2. 將小分子與互作蛋白轉為共價結合，形成類泛素化連接反應；
3. 嚴苛洗脫條件降低非特異性干擾。
經典案例：SPIDER篩選SARS-CoV-2S1蛋⽩受體結合區RBD的靶點蛋白
上海交通大學首次利用SPIDER技術檢測了SARS-CoV-2S1蛋⽩受體結合區RBD的靶蛋白，同時進行了毒性測試，證明了整個類泛素反應的無毒害性。將SPIDER實驗篩選結果與BioGRID數據庫相比較取交集，篩選到SARS-CoV-2S1蛋⽩的膜上受體蛋白ACE2，后續通過體內與體外實驗證明了二者之間的直接作用關系。
丨 方案二：非修飾的策略
No1. DARTS藥物親和反應靶向穩定性技術
藥物親和反應靶向穩定性技術（Drug Affinity Responsive Target Stability，DARTS）是由美國University of California科研團隊于2009年提出的。該方法操作簡便，可適用于大多數小分子化合物。DARTS技術是基于蛋白的酶解穩定原理，即小分子與蛋白結合后，可能使蛋白的結構發生解旋或聚集，從而使蛋白對廣譜的蛋白酶變得更加耐受或敏感。通過SDS-PAGE分離，進行實驗組和對照組的條帶比較，最后進行質譜鑒定，即可得到小分子的潛在靶點蛋白。
丨 技術路線
Step1：預實驗，摸索最適酶濃度
Step2：正式實驗，小分子與靶細胞裂解液共孵育，根據預實驗結果選取最適酶濃度處理，進行SDS-PAGE凝膠電泳
Step3：利用質譜鑒定靶點蛋白
丨 特點優勢
1. 小分子無需修飾，其構象與活性不產生影響
2. 實驗原理簡單，服務周期短
3. 每組3重復，排除個體差異
4. 不適于在自然條件下抵抗蛋白質水解的蛋白質或蛋白質結構域
經典案例：外泌體+DARTS發現人參皂苷Rb1對結直腸癌的治療作用
上海中醫藥大學曙光醫院聯合了藥物靶點和外泌體機制兩大研究熱點，發現攜帶circ-0034880的外泌體可以促進結直腸癌的肝轉移，隨后篩選到了能夠顯著抑制該環狀RNA表達的中藥活性成分人參皂苷Rb1。進一步采用DARTS技術鑒定到了人參皂苷Rb1的作用靶點是與環狀RNA生物發生相關的蛋白QKI。通過CETSA和SPR方法驗證了二者間的相互作用。最后體內功能實驗證明了Rb1預處理的腫瘤細胞來源的外泌體失去了促進癌癥肝轉移的作用。
No2. LiP-MS限制性酶解-質譜分析技術
限制性酶解-質譜分析技術LiP-MS（Limited proteolysis-coupled mass spectrometry）是一種基于有限蛋白酶切的化合物靶點篩選技術，其獨特之處在于無需對化合物進行修飾即可實現對特定化合物結合肽段進行篩選。小分子與靶點蛋白結合后，會形成空間位阻，防止蛋白酶K等廣譜蛋白酶對靶點蛋白特定多肽位點的水解。進一步利用胰酶在精氨酸和賴氨酸特定位點消化所有蛋白質后再進行質譜檢測。通過對蛋白酶K和胰酶切割差異化位點的分析，可以找到小分子作用的多肽位點以及靶點蛋白。
丨 技術路線
Step1：小分子與靶細胞裂解液共孵育
Step2：PK酶處理后進行SDS-PAGE凝膠電泳
Step3：酶解樣品，利用質譜鑒定靶點蛋白
丨 特點優勢
1. 無需對小分子進行修飾，避免了因修飾可能導致的小分子活性改變，服務周期短
2. 能夠篩選到小分子與靶點蛋白結合的肽段，可進行個性化數據分析
3. 實驗設置每組3重復，排除個體差異
4. 更適用于代謝產物及小分子量化合物的靶點篩選研究
經典案例：LiP-MS技術繪制代謝物-蛋白相互作用圖譜
蘇黎世聯邦理工學院2018年發表在Cell上的文章首次利用LiP-MS技術系地繪制了代謝物的蛋白結合譜，鑒定出三羧酸循環中大多數代謝物的靶點蛋白。在天然細胞基質中直接進行的代謝物-蛋白質相互作用和結合位點的系統分析，并確定了二者結合后靶點蛋白整體構象發生變化的原因。
No.3 CETSA細胞熱轉移技術
細胞熱轉移技術（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA）是2013年由瑞典Karolinska研究所團隊研發的一項實驗技術。該技術基于蛋白的熱穩定性原理，即小分子與靶點蛋白結合后會增強靶點蛋白的熱穩定性。隨著溫度的升高，部分蛋白會逐漸降解。相同溫度下，結合了藥物的蛋白質具有更高的熱穩定性，相比未結合藥物的蛋白質，未降解蛋白的量會提高，同時該復合蛋白的熱熔曲線發生改變，進一步通過質譜鑒定到小分子的潛在靶點蛋白。
丨 技術路線
Step1：小分子與靶細胞共孵育
Step2：進行梯度升溫處理后離心，從沉淀蛋白中分離出可溶性蛋白
Step3：收集上清液，利用質譜鑒定靶點蛋白
丨 特點優勢
1. 小分子無需修飾，其構象與活性不產生影響
2. 實驗原理簡單，服務周期短
3. 需要提供靶細胞，研究方向明確
4. 不適用于在自然條件下耐溫的蛋白質
經典案例：CETSA+MS助力揭示天然產物緩解神經性疼痛的新機制
2023年中國醫學科學院藥物研究所庾石山團隊利用CETSA+MS（TPP）技術，鑒定到木藜蘆烷毒素Rho的主要靶點蛋白N-乙基馬來酰亞胺敏感融合蛋白 （NSF），通過ITC與分子對接實驗進一步驗證了二者的的直接作用關系。結果表明Rho通過抑制NSF介導的Cav2.2鈣通道跨膜運輸緩解神經性疼痛。
