RT-PCR實(shí)驗(yàn)RNA提取及質(zhì)量確認(rèn)方法盤點(diǎn)
逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。
RNA提取：
1. 收集目的菌體；
2. 研缽置于180℃烘箱3小時(shí)，備用；
3. 采用液氮低溫研磨15分鐘至菌體破碎，可通過(guò)鏡檢查看菌體破碎效果，該過(guò)程避免破碎時(shí)間過(guò)久；
4. 吸取1 mL Trizol，充分混勻后轉(zhuǎn)移至RNase free的EP管中；
5. 在每管樣品中加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s后，室溫放置2 min；
6. 12000 rpm，4°C離心10 min，吸取350 μL上清液到新的RNase free EP管；
7. 加入350 μL 70% 的無(wú)水乙醇，吹打混勻；
8. 將上述700 μL混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000 rpm離心30 s，棄廢液；
9. 吸取700 μL的RW1到吸附柱中, 12000 rpm離心30 s，棄廢液吸取500 μL 的RW2到吸附柱中, 12000 rpm離心30 s，棄廢液；
10. 重復(fù)步驟9；
11. 12000 rpm離心2 min后，把吸附柱轉(zhuǎn)移到新的EP管；
12. 開蓋后，室溫放置5 min晾干；
13. 在吸附柱中添加60 μL RNase free的水，靜置1分鐘；
14. 12000 rpm，4℃離心1 min，將含有RNA溶液的EP管迅速置于冰上，防止降解；
取出5 μL的RNA溶液，用于后續(xù)的濃度測(cè)定以及質(zhì)量檢測(cè)，余下的RNA溶液在-80°C冰箱中保存，備用。
RT-PCR實(shí)驗(yàn)RNA的質(zhì)量確認(rèn)方法：
1、檢測(cè)RNA溶液的吸光度
280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機(jī)物的值。一般的，我們只看OD260/OD280（Ratio，R）。
1.82.0時(shí)，我們認(rèn)為RNA中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染是可以容忍的，不過(guò)要注意，當(dāng)你用Tris作為緩沖液檢測(cè)吸光度時(shí)，R值可能會(huì)大于2（一般應(yīng)該是<2.2的）。當(dāng)R<1.8時(shí)，溶液中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染比較明顯，你可以根據(jù)自己的需要決定這份RNA的命運(yùn)。當(dāng)R>2.2時(shí)，說(shuō)明RNA已經(jīng)水解成單核酸了。
如果RNA的量夠，可在260nm（A260）用分光光度法測(cè)定RNA的得率，1個(gè)單位等于40ug/mlssRNA。純RNA的A260/A280的比值為2.0。A260/A230的比值還表明RNA的純度，其值小于2.0表明裂解液中有亞硫氰胍和belta-巰基乙醇?xì)埩簦渲荡笥?.4，需用乙酸鹽，乙醇沉淀RNA。
2、RNA的電泳圖譜
一般的，RNA的電泳都是用變性膠進(jìn)行的，但是根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，如果你僅僅是為了檢測(cè)RNA的質(zhì)量是沒(méi)有必要進(jìn)行如此麻煩的實(shí)驗(yàn)的，用普通的瓊脂糖膠就可以了。
電泳的目的是在于檢測(cè)28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認(rèn)為RNA的質(zhì)量是好的。
以上是我們常用的兩種方法，但是這兩種方法都無(wú)法明確的告訴我們RNA溶液中有沒(méi)有殘留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我們很難察覺(jué)，但是大部分后續(xù)的酶學(xué)反應(yīng)都是在37度以上并且是長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行的。這樣，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中就會(huì)有非常適合的環(huán)境和時(shí)間發(fā)揮它們的作用了，當(dāng)然這時(shí)你的實(shí)驗(yàn)也就完了。
下面，我們介紹一個(gè)可以確認(rèn)RNA溶液中有沒(méi)有殘留的RNA酶的方法。
3、保溫試驗(yàn)
方法很簡(jiǎn)單的，按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,并且用pH7.0的Tris緩沖液補(bǔ)充到10 ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恒溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
時(shí)間到了之后，取出兩份樣本進(jìn)行電泳。電泳完成后，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無(wú)明顯差別（當(dāng)然，它們的條帶也要符合方法2中的條件），則說(shuō)明RNA溶液中沒(méi)有殘留的RNA酶污染，RNA的質(zhì)量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說(shuō)明RNA溶液中有RNA酶污染。
如果你的RNA樣本通過(guò)了保溫實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)并且你在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中還是非常小心的防范RNA酶的騷擾，那么你的實(shí)驗(yàn)基本上就成功了！
RNA提取：
1. 收集目的菌體；
2. 研缽置于180℃烘箱3小時(shí)，備用；
3. 采用液氮低溫研磨15分鐘至菌體破碎，可通過(guò)鏡檢查看菌體破碎效果，該過(guò)程避免破碎時(shí)間過(guò)久；
4. 吸取1 mL Trizol，充分混勻后轉(zhuǎn)移至RNase free的EP管中；
5. 在每管樣品中加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s后，室溫放置2 min；
6. 12000 rpm，4°C離心10 min，吸取350 μL上清液到新的RNase free EP管；
7. 加入350 μL 70% 的無(wú)水乙醇，吹打混勻；
8. 將上述700 μL混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000 rpm離心30 s，棄廢液；
9. 吸取700 μL的RW1到吸附柱中, 12000 rpm離心30 s，棄廢液吸取500 μL 的RW2到吸附柱中, 12000 rpm離心30 s，棄廢液；
10. 重復(fù)步驟9；
11. 12000 rpm離心2 min后，把吸附柱轉(zhuǎn)移到新的EP管；
12. 開蓋后，室溫放置5 min晾干；
13. 在吸附柱中添加60 μL RNase free的水，靜置1分鐘；
14. 12000 rpm，4℃離心1 min，將含有RNA溶液的EP管迅速置于冰上，防止降解；
取出5 μL的RNA溶液，用于后續(xù)的濃度測(cè)定以及質(zhì)量檢測(cè)，余下的RNA溶液在-80°C冰箱中保存，備用。
RT-PCR實(shí)驗(yàn)RNA的質(zhì)量確認(rèn)方法：
1、檢測(cè)RNA溶液的吸光度
280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機(jī)物的值。一般的，我們只看OD260/OD280（Ratio，R）。
1.82.0時(shí)，我們認(rèn)為RNA中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染是可以容忍的，不過(guò)要注意，當(dāng)你用Tris作為緩沖液檢測(cè)吸光度時(shí)，R值可能會(huì)大于2（一般應(yīng)該是<2.2的）。當(dāng)R<1.8時(shí)，溶液中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染比較明顯，你可以根據(jù)自己的需要決定這份RNA的命運(yùn)。當(dāng)R>2.2時(shí)，說(shuō)明RNA已經(jīng)水解成單核酸了。
如果RNA的量夠，可在260nm（A260）用分光光度法測(cè)定RNA的得率，1個(gè)單位等于40ug/mlssRNA。純RNA的A260/A280的比值為2.0。A260/A230的比值還表明RNA的純度，其值小于2.0表明裂解液中有亞硫氰胍和belta-巰基乙醇?xì)埩簦渲荡笥?.4，需用乙酸鹽，乙醇沉淀RNA。
2、RNA的電泳圖譜
一般的，RNA的電泳都是用變性膠進(jìn)行的，但是根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，如果你僅僅是為了檢測(cè)RNA的質(zhì)量是沒(méi)有必要進(jìn)行如此麻煩的實(shí)驗(yàn)的，用普通的瓊脂糖膠就可以了。
電泳的目的是在于檢測(cè)28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認(rèn)為RNA的質(zhì)量是好的。
以上是我們常用的兩種方法，但是這兩種方法都無(wú)法明確的告訴我們RNA溶液中有沒(méi)有殘留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我們很難察覺(jué)，但是大部分后續(xù)的酶學(xué)反應(yīng)都是在37度以上并且是長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行的。這樣，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中就會(huì)有非常適合的環(huán)境和時(shí)間發(fā)揮它們的作用了，當(dāng)然這時(shí)你的實(shí)驗(yàn)也就完了。
下面，我們介紹一個(gè)可以確認(rèn)RNA溶液中有沒(méi)有殘留的RNA酶的方法。
3、保溫試驗(yàn)
方法很簡(jiǎn)單的，按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,并且用pH7.0的Tris緩沖液補(bǔ)充到10 ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恒溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
時(shí)間到了之后，取出兩份樣本進(jìn)行電泳。電泳完成后，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無(wú)明顯差別（當(dāng)然，它們的條帶也要符合方法2中的條件），則說(shuō)明RNA溶液中沒(méi)有殘留的RNA酶污染，RNA的質(zhì)量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說(shuō)明RNA溶液中有RNA酶污染。
如果你的RNA樣本通過(guò)了保溫實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)并且你在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中還是非常小心的防范RNA酶的騷擾，那么你的實(shí)驗(yàn)基本上就成功了！
- 2024年"MCE中國(guó)生命科學(xué)研究促進(jìn)獎(jiǎng)"評(píng)獎(jiǎng)結(jié)果公布
- 陶術(shù)生物直播預(yù)告：受體藥理學(xué)與藥物發(fā)現(xiàn)研究
- 安捷倫免疫組化法PD-L1檢測(cè)試劑盒獲得歐盟IVDR認(rèn)證
- 德國(guó)Massive Photonics推出多款DNA-PAINT各系試劑盒
- 天隆自主研發(fā)HCV核酸檢測(cè)試劑盒獲批藥監(jiān)局三類NMPA
- 蘭博利德推出新品高保真快速擴(kuò)增 PCR mix試劑盒
- IPHASE邀您共赴BIOCHINA2025第十屆易貿(mào)生物產(chǎn)業(yè)大會(huì)
- 2025年廣西臨床檢驗(yàn)儀器、試劑與輸血用品展通知
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com