RNA的提取方法TRIzol法的原理及優(yōu)缺點(diǎn)
RNA抽提有很多種方法，其中TRIzol法是最流行的。
TRIzol作用原理：
TRIzol的主要成分是苯酚、8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等。
其中，苯酚的作用是（1）、裂解細(xì)胞（2）、變性蛋白；8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇的作用是抑制RNase。
一、TRIzol法的優(yōu)缺點(diǎn)：
優(yōu)點(diǎn)：
快速；
能抽提多種屬總RNA；
對(duì)少量的組織和細(xì)胞以及大量的組織和細(xì)胞都能有效分離；
能抽提不同分子量大小的多種RNA；
能夠避免DNA和蛋白的污染；
抽提出來(lái)的RNA適用于多種實(shí)驗(yàn)；
另外，樣品中基因組DNA比例高，或酶、脂肪含量高，或者習(xí)慣使用盡可能多的樣品時(shí)建議使用該方法，并且該方法可以同時(shí)對(duì)DNA、RNA和蛋白進(jìn)行分別提取，在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA在水相中，取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA，在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原，用乙醇沉淀中間層可回收DNA，用異丙醇沉淀有機(jī)相可回收蛋白質(zhì)。
缺點(diǎn)：
由于取上清比較復(fù)雜，速度慢，且不容易取凈，容易丟失較多的RNA，樣本量較大或RNA豐度不高的組織提取時(shí)不建議使用，且需要使用氯仿、苯酚等有毒試劑。
二、RNA的提取：
1、從液氮中取出組織后，快速的拿到超凈臺(tái)上，放入小皿中，加入trizol試劑，（100mg的組織放入1.2ml的trizol試劑），用注射器進(jìn)行研磨，注意要熟練，快速研磨。（下面加的試劑按照1ml trizol的比例添加即可）。
2、細(xì)胞或組織加入Trizol研磨后，15~30℃孵育15min，使其充分裂解。(此時(shí)如果不接著做下面的實(shí)驗(yàn)可以凍存于-80℃低溫冰箱)。
3、4℃，12000轉(zhuǎn)，離心5min ,棄沉淀。（超凈臺(tái)準(zhǔn)備好EP管，離心后，吸取上清至準(zhǔn)備好的EP管中）按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，劇烈振蕩15s,（用手震蕩即可）15~30℃孵育2~3min。注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。（氯仿又叫三氯甲烷chloroform，一般儲(chǔ)存在4℃冰箱中）。
4、4℃，12000轉(zhuǎn),離心15min。吸取上層水相，至另一離心管中。注：（1）吸取水相要小心，千萬(wàn)不要吸取中間界面。可采用小槍頭少量多次吸�。�2）若同時(shí)提取DNA和蛋白質(zhì)，則保存下層有機(jī)相，存于4℃冰箱內(nèi)備用，否則棄下層有機(jī)相。
5、按500ul異丙醇/ml Trizol 的比例加入異丙醇，用手震蕩一下，15~30℃（室溫即可）孵育10min。2~8℃，12000g,離心10min,棄上清，RNA沉于管底。按1ml 75％乙醇／ml Trizol加入75％乙醇，漩渦混勻，懸浮沉淀。（注：75％乙醇用DEPC水配制）。
6、4℃，7500轉(zhuǎn)離心5min，盡量棄盡上清（注：用完離心機(jī)關(guān)電源后，將離心機(jī)蓋打開(kāi)30分鐘降溫，再蓋上）室溫晾干或真空干燥5~10min。（注：不能用離心的方法使RNA干燥，RNA樣品不要過(guò)于干燥，否則很難溶解。）
7、1×RNAsafe30 ul（或1‰DEPC水30ul）溶解RNA沉淀,60℃水浴20min（注：用蒸餾水配置1/100的DEPC水高壓后才能用,20×RNAsafe 用DEPC水稀釋）測(cè)OD值定量RNA濃度（用DU800紫外光度計(jì)測(cè)量）如果提取的RNA不進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄可在-80℃保存。
TRIzol作用原理：
TRIzol的主要成分是苯酚、8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等。
其中，苯酚的作用是（1）、裂解細(xì)胞（2）、變性蛋白；8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇的作用是抑制RNase。
一、TRIzol法的優(yōu)缺點(diǎn)：
優(yōu)點(diǎn)：
快速；
能抽提多種屬總RNA；
對(duì)少量的組織和細(xì)胞以及大量的組織和細(xì)胞都能有效分離；
能抽提不同分子量大小的多種RNA；
能夠避免DNA和蛋白的污染；
抽提出來(lái)的RNA適用于多種實(shí)驗(yàn)；
另外，樣品中基因組DNA比例高，或酶、脂肪含量高，或者習(xí)慣使用盡可能多的樣品時(shí)建議使用該方法，并且該方法可以同時(shí)對(duì)DNA、RNA和蛋白進(jìn)行分別提取，在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA在水相中，取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA，在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原，用乙醇沉淀中間層可回收DNA，用異丙醇沉淀有機(jī)相可回收蛋白質(zhì)。
缺點(diǎn)：
由于取上清比較復(fù)雜，速度慢，且不容易取凈，容易丟失較多的RNA，樣本量較大或RNA豐度不高的組織提取時(shí)不建議使用，且需要使用氯仿、苯酚等有毒試劑。
二、RNA的提取：
1、從液氮中取出組織后，快速的拿到超凈臺(tái)上，放入小皿中，加入trizol試劑，（100mg的組織放入1.2ml的trizol試劑），用注射器進(jìn)行研磨，注意要熟練，快速研磨。（下面加的試劑按照1ml trizol的比例添加即可）。
2、細(xì)胞或組織加入Trizol研磨后，15~30℃孵育15min，使其充分裂解。(此時(shí)如果不接著做下面的實(shí)驗(yàn)可以凍存于-80℃低溫冰箱)。
3、4℃，12000轉(zhuǎn)，離心5min ,棄沉淀。（超凈臺(tái)準(zhǔn)備好EP管，離心后，吸取上清至準(zhǔn)備好的EP管中）按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，劇烈振蕩15s,（用手震蕩即可）15~30℃孵育2~3min。注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。（氯仿又叫三氯甲烷chloroform，一般儲(chǔ)存在4℃冰箱中）。
4、4℃，12000轉(zhuǎn),離心15min。吸取上層水相，至另一離心管中。注：（1）吸取水相要小心，千萬(wàn)不要吸取中間界面。可采用小槍頭少量多次吸�。�2）若同時(shí)提取DNA和蛋白質(zhì)，則保存下層有機(jī)相，存于4℃冰箱內(nèi)備用，否則棄下層有機(jī)相。
5、按500ul異丙醇/ml Trizol 的比例加入異丙醇，用手震蕩一下，15~30℃（室溫即可）孵育10min。2~8℃，12000g,離心10min,棄上清，RNA沉于管底。按1ml 75％乙醇／ml Trizol加入75％乙醇，漩渦混勻，懸浮沉淀。（注：75％乙醇用DEPC水配制）。
6、4℃，7500轉(zhuǎn)離心5min，盡量棄盡上清（注：用完離心機(jī)關(guān)電源后，將離心機(jī)蓋打開(kāi)30分鐘降溫，再蓋上）室溫晾干或真空干燥5~10min。（注：不能用離心的方法使RNA干燥，RNA樣品不要過(guò)于干燥，否則很難溶解。）
7、1×RNAsafe30 ul（或1‰DEPC水30ul）溶解RNA沉淀,60℃水浴20min（注：用蒸餾水配置1/100的DEPC水高壓后才能用,20×RNAsafe 用DEPC水稀釋）測(cè)OD值定量RNA濃度（用DU800紫外光度計(jì)測(cè)量）如果提取的RNA不進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄可在-80℃保存。
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