PCR反應實驗原理及體系解讀
PCR反應實驗原理：
PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶鏈式反應，可以選擇性擴增一段DNA序列。其基本步驟是，首先將待擴增的模板DNA變性使之成為單鏈，DNA樣品中，特異性的引物能夠與其互補的序列雜交，在dNTPs和Taq酶存在時，就可以合成模板DNA的互補鏈，反應完成后，將反應混合物加熱使DNA雙鏈變性，溫度下降后，過量的引物又可以開始第二輪的合成反應。這種延伸-變性-退火-延伸的循環可以重復多次，使所需要的DNA片段得到特異性的擴增。
1. 變性：加熱使模板DNA在高溫下（94℃）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈.
2. 退火：使溶液溫度降至50～60℃，模板DNA與引物按堿基配對原則互補結合.
3. 延伸：溶液反應溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導下，利用反應混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTPs），按5ˊ→3ˊ方向復制出互補DNA。
上述3步為一個循環，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個階段。從理論上講，每經過一個循環，樣本中的DNA量應該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環的模板，經過25～30個循環后DNA可擴增106～109倍。
PCR反應體系：
PCR 反應體系由反應緩沖液（10×PCR Buffer）、脫氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、
耐熱 DNA 聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA 模板）
五部分組成。各個組份都能影響 PCR 結果的好壞。
1．反應緩沖液：
一般隨 Taq DNA 聚合酶供應。標準緩沖液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl
（pH8.3 室溫），1.5mM MgCl2。Mg2+的濃度對反應的特異性及產量有著顯著影響。濃
度過高，使反應特異性降低；濃度過低，使產物減少。在各種單核苷酸濃度為 200μM 時，
Mg2+為 1.5mM 較合適。若樣品中含 EDTA 或其它螯合物，可適當增加 Mg2+的濃度。在
高濃度 DNA 及 dNTP 條件下進行反應時，也必須相應調節 Mg2+的濃度。一般
以 1.5-2mM（終濃度）較好。
2． dNTP ：
高濃度 dNTP 易產生錯誤摻入，過高則可能不擴增；但濃度過低，將降低反
應產物的產量。PCR 中常用終濃度為 50-400μM 的 dNTP。四種脫氧三磷酸核苷酸的濃度
應相同，如果其中任何一種的濃度明顯不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會誘發聚合酶
的錯誤摻入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應。此外，dNTP 能與 Mg2+結合，使
游離的 Mg2+濃度降低。因此，dNTP 的濃度直接影響到反應中起重要作用的 Mg2+濃度。
3． Taq DNA 聚合酶酶：
在 100μl 反應體系中，一般加入 2-4U 的酶量，足以達到每 min
延伸 1000-4000 個核苷酸的摻入速度。酶量過多將導致產生非特異性產物。但是，不同的
公司或不同批次的產品常有很大的差異，由于酶的濃度對 PCR 反應影響極大，因此應當作
預試驗或使用廠家推薦的濃度。當降低反應體積時（如 20μl 或 50μl），一般酶的用量仍不
小于 2U，否則反應效率將降低。
4． 引物：
引物是決定 PCR 結果的關鍵，引物設計在 PCR 反應中極為重要。要保證 PCR
反應能準確、特異、有效地對模板 DNA 進行擴增，通常引物設計要遵循以下幾條原則：⑴ 引物的長度以 15-30bp 為宜，一般（G+C）的含量在 45-55%，Tm 值高于 55℃
［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。應盡量避免數個嘌呤或嘧啶的連續排列，堿基的分布應表現出
是隨機的。
⑵ 引物的 3’端不應與引物內部有互補，避免引物內部形成二級結構，兩個引物在 3’端
不應出現同源性，以免形成引物二聚體。3’端末位堿基在很大程度上影響著 Taq 酶的延伸
效率。兩條引物間配對堿基數少于 5 個，引物自身配對若形成莖環結構，莖的堿基對數不
能超過 3 個由于影響引物設計的因素比較多，現常常利用計算機輔助設計。
⑶ 人工合成的寡聚核苷酸引物需經 PAGE 或離子交換 HPLC 進行純化。
⑷ 引物濃度不宜偏高，濃度過高有兩個弊端：一是容易形成引物二聚體（primer-dimer），
二是當擴增微量靶序列并且起始材料又比較粗時，容易產生非特異性產物。一般說來，用低
濃度引物不僅經濟，而且反應特異性也較好。一般用 0.25-0.5pM/μl 較好。
⑸ 引物一般用 TE 配制成較高濃度的母液（約 100μM），保存于-20℃。使用前取出其中
一部分用 ddH2O 配制成 10μM 或 20μM 的工作液。
5、模板：
PCR 對模板的要求不高，單、雙鏈 DNA 均可作為 PCR 的樣品。雖然 PCR 可以
用極微量的樣品（甚至是來自單一細胞的 DNA）作為摸板，但為了保證反應的特異性，一
般還宜用μg 水平的基因組 DNA 或 104 拷貝的待擴增片段作為起始材料。原材料可以是粗
制品，某些材料甚至僅需用溶劑一步提取之后即可用于擴增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、
Taq DNA 聚合酶抑制劑以及能結合 DNA 的蛋白，將可能干擾 PCR 反應。
PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶鏈式反應，可以選擇性擴增一段DNA序列。其基本步驟是，首先將待擴增的模板DNA變性使之成為單鏈，DNA樣品中，特異性的引物能夠與其互補的序列雜交，在dNTPs和Taq酶存在時，就可以合成模板DNA的互補鏈，反應完成后，將反應混合物加熱使DNA雙鏈變性，溫度下降后，過量的引物又可以開始第二輪的合成反應。這種延伸-變性-退火-延伸的循環可以重復多次，使所需要的DNA片段得到特異性的擴增。
1. 變性：加熱使模板DNA在高溫下（94℃）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈.
2. 退火：使溶液溫度降至50～60℃，模板DNA與引物按堿基配對原則互補結合.
3. 延伸：溶液反應溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導下，利用反應混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTPs），按5ˊ→3ˊ方向復制出互補DNA。
上述3步為一個循環，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個階段。從理論上講，每經過一個循環，樣本中的DNA量應該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環的模板，經過25～30個循環后DNA可擴增106～109倍。
PCR反應體系：
PCR 反應體系由反應緩沖液（10×PCR Buffer）、脫氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、
耐熱 DNA 聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA 模板）
五部分組成。各個組份都能影響 PCR 結果的好壞。
1．反應緩沖液：
一般隨 Taq DNA 聚合酶供應。標準緩沖液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl
（pH8.3 室溫），1.5mM MgCl2。Mg2+的濃度對反應的特異性及產量有著顯著影響。濃
度過高，使反應特異性降低；濃度過低，使產物減少。在各種單核苷酸濃度為 200μM 時，
Mg2+為 1.5mM 較合適。若樣品中含 EDTA 或其它螯合物，可適當增加 Mg2+的濃度。在
高濃度 DNA 及 dNTP 條件下進行反應時，也必須相應調節 Mg2+的濃度。一般
以 1.5-2mM（終濃度）較好。
2． dNTP ：
高濃度 dNTP 易產生錯誤摻入，過高則可能不擴增；但濃度過低，將降低反
應產物的產量。PCR 中常用終濃度為 50-400μM 的 dNTP。四種脫氧三磷酸核苷酸的濃度
應相同，如果其中任何一種的濃度明顯不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會誘發聚合酶
的錯誤摻入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應。此外，dNTP 能與 Mg2+結合，使
游離的 Mg2+濃度降低。因此，dNTP 的濃度直接影響到反應中起重要作用的 Mg2+濃度。
3． Taq DNA 聚合酶酶：
在 100μl 反應體系中，一般加入 2-4U 的酶量，足以達到每 min
延伸 1000-4000 個核苷酸的摻入速度。酶量過多將導致產生非特異性產物。但是，不同的
公司或不同批次的產品常有很大的差異，由于酶的濃度對 PCR 反應影響極大，因此應當作
預試驗或使用廠家推薦的濃度。當降低反應體積時（如 20μl 或 50μl），一般酶的用量仍不
小于 2U，否則反應效率將降低。
4． 引物：
引物是決定 PCR 結果的關鍵，引物設計在 PCR 反應中極為重要。要保證 PCR
反應能準確、特異、有效地對模板 DNA 進行擴增，通常引物設計要遵循以下幾條原則：⑴ 引物的長度以 15-30bp 為宜，一般（G+C）的含量在 45-55%，Tm 值高于 55℃
［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。應盡量避免數個嘌呤或嘧啶的連續排列，堿基的分布應表現出
是隨機的。
⑵ 引物的 3’端不應與引物內部有互補，避免引物內部形成二級結構，兩個引物在 3’端
不應出現同源性，以免形成引物二聚體。3’端末位堿基在很大程度上影響著 Taq 酶的延伸
效率。兩條引物間配對堿基數少于 5 個，引物自身配對若形成莖環結構，莖的堿基對數不
能超過 3 個由于影響引物設計的因素比較多，現常常利用計算機輔助設計。
⑶ 人工合成的寡聚核苷酸引物需經 PAGE 或離子交換 HPLC 進行純化。
⑷ 引物濃度不宜偏高，濃度過高有兩個弊端：一是容易形成引物二聚體（primer-dimer），
二是當擴增微量靶序列并且起始材料又比較粗時，容易產生非特異性產物。一般說來，用低
濃度引物不僅經濟，而且反應特異性也較好。一般用 0.25-0.5pM/μl 較好。
⑸ 引物一般用 TE 配制成較高濃度的母液（約 100μM），保存于-20℃。使用前取出其中
一部分用 ddH2O 配制成 10μM 或 20μM 的工作液。
5、模板：
PCR 對模板的要求不高，單、雙鏈 DNA 均可作為 PCR 的樣品。雖然 PCR 可以
用極微量的樣品（甚至是來自單一細胞的 DNA）作為摸板，但為了保證反應的特異性，一
般還宜用μg 水平的基因組 DNA 或 104 拷貝的待擴增片段作為起始材料。原材料可以是粗
制品，某些材料甚至僅需用溶劑一步提取之后即可用于擴增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、
Taq DNA 聚合酶抑制劑以及能結合 DNA 的蛋白，將可能干擾 PCR 反應。
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