m5C MeRIP-seq等揭示m5C修飾在癌癥耐藥中的關鍵調控機制中的應用
甲狀腺未分化癌（Anaplastic Thyroid Cancer, ATC）是一種極具侵襲性的甲狀腺癌，通常在初診時就已出現局部晚期浸潤或遠處轉移，錯過了最佳手術時機。因此，系統化療和靶向治療對于改善ATC患者的預后至關重要。然而，ATC對傳統治療表現出顯著的耐藥性，這使得研究其耐藥機制并發現新的治療靶點成為當務之急。近年來，RNA修飾（尤其是m5C修飾）在腫瘤發生和耐藥性中的作用逐漸受到關注，但其在ATC中的具體機制尚不清楚。
近日，天津醫科大學腫瘤醫院鄭向前教授團隊以甲狀腺未分化癌（ATC）為研究對象，利用m5C MeRIP-seq等技術揭示了NSUN2介導的m5C修飾在ATC耐藥性中的作用機制，闡明了NSUN2/SRSF6/UAP1信號軸在ATC多藥耐藥性（Multidrug Resistance, MDR）中的關鍵作用，并提出通過小分子NSUN2抑制劑克服耐藥性的新策略。這一發現不僅為ATC的治療提供了新的靶點，也為理解RNA修飾在腫瘤耐藥性中的作用提供了重要依據。相關研究成果以《NSUN2-mediated m5C modification drives alternative splicing reprogramming and promotes multidrug resistance in anaplastic thyroid cancer through the NSUN2/SRSF6/UAP1 signaling axis》為題發表于《Theranostics》雜志。
標題：NSUN2-mediated m5C modification drives alternative splicing reprogramming and promotes multidrug resistance in anaplastic thyroid cancer through the NSUN2/SRSF6/UAP1 signaling axis（NSUN2介導的m5C修飾通過NSUN2/SRSF6/UAP1信號軸驅動可變剪切重編程并促進甲狀腺未分化癌的多藥耐藥性）
發表時間：2025-1-27
發表期刊：Theranostics
影響因子：IF 12.4/Q1
技術平臺：MeRIP-seq、scRNA-seq、bulk RNA-seq（易基因金牌技術）
本研究通過對ATC樣本的bulk轉錄組（bulk RNA-seq）和單細胞RNA測序（scRNA-seq）數據進行全面分析，以篩選與多藥耐藥性（MDR）相關的m5C修飾基因。隨后進行IC50實驗、流式細胞術分析，并利用Nsun2基因敲除的自發性甲狀腺癌（spontaneous tumorigenic ATC）小鼠模型，證明了NSUN2在ATC中促進MDR的作用。為了探究NSUN2介導的耐藥機制，研究構建了NSUN2基因敲除的ATC細胞系，并進行轉錄組學、蛋白質組學和MeRIP-seq分析。此外還通過RNA-seq測序和可變剪切(alternative splicing，AS)分析，研究NSUN2敲除后的整體變化。進一步通過糖蛋白染色、變性免疫沉淀泛素化、核質分離和PCR等方法，探討了NSUN2/SRSF6/UAP1軸的潛在機制。最后在體外和體內評估了小分子NSUN2抑制劑與抗癌藥物的協同效應。
研究結果表明，NSUN2表達與ATC中的MDR顯著相關。NSUN2作為m5C的“writer”，ALYREF作為“reader”，它們共同作用于SRSF6 mRNA，誘導可變剪切重編程，并將UAP1基因的剪接形式從AGX1轉向AGX2。結果表明，AGX2增強了ABC轉運蛋白的N-糖基化，通過抑制泛素化介導的降解以穩定這些蛋白。NSUN2抑制劑通過降低NSUN2酶活性并減少下游靶標表達，為克服ATC中的MDR提供了一種新的、有前景的治療策略。
本研究揭示了NSUN2/SRSF6/UAP1信號軸在ATC的MDR中的關鍵作用，并確定了NSUN2作為化療和靶向治療的協同靶點。
研究方法
生物信息學分析：通過分析ATC樣本的bulk RNA-seq測序數據，篩選與MDR相關的m5C修飾基因。
細胞實驗和分子機制研究：利用CRISPR/Cas9技術構建NSUN2基因敲除（knockout）的ATC細胞系，通過RNA-seq、蛋白質組學和MeRIP-seq分析等技術研究NSUN2的功能。
動物模型：構建Nsun2基因敲除的自發性甲狀腺癌小鼠模型，評估NSUN2體內對MDR影響。
藥物敏感性分析：通過IC50實驗和流式細胞術檢測NSUN2抑制劑與抗癌藥物的聯合效應。
研究結果
（1）生物信息學分析揭示ATC中NSUN2和多藥耐藥性（MDR）之間的相關性
通過分析Cancer Therapeutics Response Portal（CTRP）數據庫中的藥物敏感性數據，發現NSUN2的表達與多種抗癌藥物（包括化療藥物和酪氨酸激酶抑制劑）的IC50值呈正相關。
利用GEO數據庫中的ATC轉錄組數據，將患者分為高NSUN2表達組和低NSUN2表達組，發現高NSUN2表達與細胞分裂、有絲分裂、細胞周期等化療靶向過程相關。
scRNA-seq測序分析顯示，NSUN2在ATC細胞中的表達與多種化療藥物和TKI的耐藥性相關。
圖1：生物信息學分析揭示NSUN2與ATC中多藥耐藥性（MDR）的相關性。
A）來自CTRP數據庫的ATC患者基因表達與藥物敏感性的Spearman相關性分析。
B-C）高NSUN2表達組與低NSUN2表達組之間差異表達基因（DEGs）的富集通路總結。
D）ATC的scRNA-seq數據的tSNE圖，展示了鑒定出的細胞clusters（n=10）。
E）散點圖顯示NSUN2陽性細胞與NSUN2陰性細胞的log2倍變化（log2FC）及其與每種藥物預測的IC50曲線下面積（AUC）值的相關性。
F）蝴蝶圖展示NSUN2表達、藥物敏感性與基因本體（GO）通路分析之間的相關性。
G）ATC的scRNA-seq數據的tSNE圖，展示了鑒定出的細胞clusters（n=10）。
H）使用Beyondcell對GEO數據集樣本進行的單細胞藥物敏感性分析。
I）NSUN2表達與Beyondcell評分之間的相關性。
（2）ATC中NSUN2誘導的MDR取決于其甲基轉移酶活性
在ATC細胞系中敲低或敲除NSUN2后，細胞對多種藥物的敏感性顯著增加，表明NSUN2表達與MDR密切相關。
通過構建NSUN2催化活性突變體（C271A），發現只有野生型NSUN2能夠恢復m5C修飾活性和藥物耐受性，表明NSUN2的甲基轉移酶活性是其誘導MDR的關鍵。
B）通過點雜交實驗檢測NSUN2基因敲除對Cal-62細胞mRNA轉錄組中m5C水平的影響。
C）通過比色法m5C定量實驗確認NSUN2基因敲除后Cal-62細胞中m5C水平的變化。
D-F）通過細胞生長抑制實驗評估NSUN2基因敲除對Cal-62細胞對多柔比星（doxorubicin）、順鉑（cisplatin）和侖伐替尼（lenvatinib）敏感性的影響。
G）通過Western blot分析檢測Cal-62細胞經不同處理后NSUN2蛋白的相對表達量。
H）通過點雜交實驗檢測經載體處理后Cal-62細胞mRNA轉錄組中m5C豐度。
I）通過比色法m5C定量實驗確認經處理后Cal-62細胞中m5C水平變化。
J-L）通過細胞生長抑制實驗評估經不同載體轉染的Cal-62細胞的IC50值。
M）自發性ATC小鼠模型的構建方案，包括靶向策略（左）和繁殖方案（右）。
N）小鼠基因分型結果，其中TPO-cre的DNA凝膠條帶大小為130/324bp，BrafV600E為185/307bp，Trp53flox/flox為290/370bp，Nsun2flox/flox為151/212bp。
O）在基因工程小鼠中多柔比星、順鉑和侖伐替尼的給藥方案。mATC（小鼠甲狀腺未分化癌）。
P）散點圖顯示各組小鼠的最終腫瘤重量。
Q）散點圖顯示各組小鼠的最終腫瘤體積。
R）顯示各組ATC小鼠的生存曲線。
（3）在ATC中，NSUN2介導的m5C修飾通過靶向SRSF6驅動可變剪切重編程
蛋白質組學分析顯示，NSUN2敲除后，與RNA剪接相關的蛋白表達發生顯著變化，其中SRSF6蛋白表達顯著下調，而其mRNA水平不變。
MeRIP-seq和qPCR結果表明，NSUN2通過m5C修飾調節SRSF6 mRNA的核質轉運，進而影響其蛋白表達。
通過突變SRSF6 mRNA上的m5C修飾位點，發現這些位點對SRSF6的核質轉運至關重要。
B）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后TMT-MS數據的GO富集分析。
C）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后差異剪接基因的百分比剪接包含（ΔPSI）的火山圖。
D）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后顯著ΔPSI變化的小提琴圖。
E）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后SF3A/B、U2AF核心復合體和hnRNP家族中DEG熱圖。
F）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后TMT-MS數據中SRSF6蛋白水平的統計分析。
G）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后指示蛋白的Western blot分析。
H）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后SRSF6基因座周圍的MeRIP-seq數據的IGV軌跡圖。
I）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后SRSF6 mRNA中m5C富集的MeRIP-qPCR檢測。
J）經指示載體處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA中m5C富集的MeRIP-qPCR分析。
K）NSUN2基因敲除后Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質分布qRT-PCR分析。
L）經指示載體處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質分布。
M）經指示載體處理的Cal-62細胞中指示蛋白的Western blot分析。
N）SRSF6中的典型m5C結合位點。頂部為m5C結合位點的motif序列；底部為SRSF6中鑒定的m5C位點。
O）經指示載體處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA中m5C富集的MeRIP-qPCR定量。
P）經指示載體處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質分布。
（4）NSUN2通過增強ABC轉運蛋白的N-糖基化促進ATC中的MDR
轉錄組分析和KEGG通路分析顯示，NSUN2參與N-糖鏈生物合成過程。
通過糖蛋白染色和蛋白質印跡分析，發現NSUN2敲除后，ABC轉運蛋白（ABCC1和ABCG2）的N-糖基化水平降低，蛋白穩定性下降。
流式細胞術檢測顯示，NSUN2敲除細胞對藥物攝取增加，表明藥物外排減少，耐藥性降低。
B-C）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后轉錄數據的基因集富集分析（GSEA）。
D）總蛋白的考馬斯亮藍染色（左），NSUN2基因敲除后Cal-62細胞的糖蛋白染色結果（右）。
E-F）經或未經TM（tunicamycin）、SS（swainsonine）處理的Cal-62細胞中指示蛋白水平的Western blot分析。細胞裂解樣本經或未經PNGase F處理。“G”表示N-糖基化，“DG”表示N-糖基化減少。
G）NSUN2基因敲除的Cal-62細胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
H）代表性免疫組化（IHC）圖像顯示35例ATC組織中NSUN2、ABCG2和ABCC1的表達情況。
I-J）采用卡方檢驗分析NSUN2與ABCG2或ABCC1表達之間的相關性。
K-L）NSUN2與ABCG2或ABCC1的IHC評分的相關性分析。
M-N）使用NetNglyc服務器預測的ABCG2和ABCC1的潛在N-糖基化天冬酰胺位點。
O-P）分別在轉染了N557Q、N388Q、N596Q或N71Q、N19Q、N310Q、N(71+310)Q突變質粒的Cal-62細胞中，通過Western blot檢測ABCG2和ABCC1的表達情況。
Q-S）NSUN2基因敲除后Cal-62細胞中多柔比星、順鉑和侖伐替尼的細胞內積累情況的流式細胞儀分析。右側顯示平均熒光強度的定量結果。
（5）NSUN2通過N-糖基化增強ABC轉運蛋白的穩定性
通過western blot 分析和泛素化實驗，發現NSUN2敲除后，ABCC1和ABCG2的泛素化水平增加，表明N-糖基化缺失導致這些蛋白更容易被降解。
使用蛋白酶體抑制劑MG132可以部分恢復ABCC1和ABCG2的蛋白水平，進一步證實了N-糖基化對蛋白穩定性的影響。
B）NSUN2基因敲除的Cal-62細胞經不同濃度的MG132處理后，使用指定抗體進行Western blot分析。
C）經TM和MG132處理的Cal-62細胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
D）使用ImageJ軟件對ABCC1和ABCG2蛋白水平進行定量分析。
E-F）經TM和MG132處理的Cal-62細胞進行ABCC1或ABCG2免疫沉淀（IP），隨后使用抗泛素抗體進行Western blot分析。
G）NSUN2基因敲除且經MG132處理的Cal-62細胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
H）使用ImageJ軟件對ABCC1和ABCG2蛋白強度進行定量分析。
I-J）NSUN2基因敲除且經MG132處理的Cal-62細胞進行ABCC1或ABCG2免疫沉淀（IP），隨后使用抗泛素抗體進行Western blot分析。
K-L）在Cal-62細胞中表達的野生型（WT）或指示的ABCG2/ABCC1突變體經125μg/mL環己酰亞胺（CHX）處理特定時間間隔后，通過Western blot進行分析。
M-N）使用ImageJ軟件對ABCG2或ABCC1的蛋白強度定量分析，并以β-Actin水平歸一化。
（6）NSUN2通過介導UAP1到SRSF6的可變剪切來促進N-糖基化
UAP1是N-糖基化反應中UDP-GlcNAc合成的關鍵酶，其有兩種亞型（AGX1和AGX2）。
NSUN2敲除后，UAP1的剪接形式從AGX2轉變為AGX1，導致N-糖基化活性降低。
通過過表達SRSF6，可以逆轉這一剪接變化，恢復N-糖基化水平和藥物耐受性。
B）Sashimi圖顯示NSUN2基因敲除后Cal-62細胞中UAP1剪切事件的變化。
C）對照組與NSUN2基因敲除的Cal-62細胞中UAP1剪切的RT-PCR分析。
D）自發性小鼠ATC腫瘤中UAP1的剪切事件的RT-PCR，有或沒有Nsun2基因敲除。
E）經指示載體處理的Cal-62細胞中UAP1剪切事件的RT-PCR（上圖）。Western blot分析了SRSF6重建（下圖）。
F）檢測總蛋白的考馬斯亮藍染色（左）。經指示載體處理的Cal-62細胞糖蛋白染色（右）。
G）經指示載體處理的Cal-62細胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
H-J）經指示載體處理的Cal-62細胞中多柔比星、順鉑和侖伐替尼的細胞內積累情況的流式細胞儀分析。右側顯示了平均熒光強度的定量結果。
K-M）指示載體處理Cal-62細胞對多柔比星、順鉑和侖伐替尼敏感影響細胞生長抑制實驗。
N-P）指示載體處理Cal-62細胞對多柔比星、順鉑和侖伐替尼反應影響的腫瘤生長曲線。
Q-S）指示載體處理Cal-62細胞對多柔比星、順鉑和侖伐替尼反應影響腫瘤最終重量。
（7）作為m5C的“reader”， ALYREF可以鑒定SRSF6并將其從細胞核轉運至細胞質
通過RNA免疫沉淀（RIP）和RNA下拉實驗，發現ALYREF能夠直接結合m5C修飾的SRSF6 mRNA，并將其從細胞核轉運至細胞質。
ALYREF的K171A突變體顯著降低對m5C -SRSF6結合能力，表明ALYREF是m5C修飾的“reader”。
ALYREF敲低或過表達可以調控SRSF6的細胞核質轉運和蛋白表達，進而影響藥物耐受性。
C）熱圖顯示在NSUN2基因敲除或ALYREF、YBX1和SRSF2基因敲低的Cal-62細胞中與多柔比星和順鉑耐藥性相關的基因。
D）通過RIP-qPCR檢測ALYREF與Cal-62細胞中SRSF6的結合。
E）通過Western blot分析從SRSF6（m5C）下拉實驗中獲得的指示蛋白。
F）通過RIP-qPCR比較在經指示載體處理的Cal-62細胞中，野生型ALYREF（ALYREF-WT）和K171A突變型ALYREF（ALYREF-K171A）與SRSF6的結合。
G）通過RIP-qPCR評估NSUN2基因敲除后Cal-62細胞中ALYREF與SRSF6 mRNA的結合。
H）通過RIP-qPCR評估經指示載體處理的Cal-62細胞中ALYREF與SRSF6 mRNA的結合。
I）通過qRT-PCR實驗評估ALYREF基因敲低的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質分布。
J）在過表達ALYREF或ALYREF-K171A突變體的Cal-62細胞中，SRSF6 mRNA的核質分布。
K）經指示載體處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質分布。
L-N）細胞生長抑制實驗評估指示載體處理對Cal-62細胞對多柔比星、順鉑和侖伐替尼反應的影響。
O）通過Western blot分析經指示載體處理的Cal-62細胞中指示蛋白的水平。
P）NSUN2基因敲除的Cal-62細胞中ALYREF的免疫熒光染色（左側）以及核/質ALYREF分布的定量分析（右側）。
Q）通過Western blot分析（左側）以及相應的定量分析（右側），展示對照組和NSUN2基因敲除的Cal-62細胞中核和質ALYREF的水平，PARP1和TUBULIN分別作為核和質標記。
（8）小分子NSUN2抑制劑增強ATC中多藥敏感性
設計并合成小分子NSUN2抑制劑（NSUN2i），能夠顯著降低ATC細胞中的m5C水平。
NSUN2i處理后，SRSF6的核質轉運受阻，UAP1剪接形式改變，N-糖基化水平降低，ABC轉運蛋白穩定性下降。
體外實驗和動物模型實驗均顯示，NSUN2i與化療藥物或TKI聯合使用可以顯著增強藥物的抗腫瘤效果。
B）基于RT-qPCR的MeRIP檢測NSUN2基因敲除的經或未經NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的m5C富集分析。
C）通過qRT-PCR實驗評估NSUN2基因敲除的經或未經NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質分布。
D）通過Western blot分析NSUN2基因敲除的經或未經NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞中指示蛋白的水平。
E）RT-PCR顯示經或未經NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞和ACT-1細胞中UAP1的剪接事件。
F）檢測總蛋白的考馬斯亮藍染色（左），經或未經NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞和ACT-1細胞的糖蛋白染色（右）。
G）通過Western blot分析經或未經NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞和ACT-1細胞中指示蛋白的水平。
H-J）通過流式細胞儀分析經或未經NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞中多柔比星、順鉑和侖伐替尼的細胞內積累情況。右側顯示平均熒光強度的定量結果。
K-M）細胞生長抑制實驗評估NSUN2抑制劑與多柔比星、順鉑或侖伐替尼聯合使用對Cal-62細胞的影響。
N）展示在基因工程小鼠中NSUN2抑制劑、多柔比星、順鉑和侖伐替尼的給藥方案示意圖。
O）散點圖顯示各組小鼠的最終腫瘤重量。
P）散點圖顯示各組小鼠的最終腫瘤體積。
Q）顯示各組ATC小鼠的生存曲線。
討論和局限性
本研究揭示了NSUN2通過m5C修飾調節SRSF6的細胞核質轉運，進而影響UAP1剪切和N-糖基化水平，最終導致ATC耐藥性的機制。研究結果表明，NSUN2及其下游靶點是靶向ATC耐藥性的潛在治療靶點。
然而，NSUN2在正常細胞生理中也發揮重要作用，系統性抑制NSUN2可能會帶來安全性問題。此外，如何實現NSUN2抑制劑的腫瘤特異性遞送仍然是一個挑戰。
易小結
本研究通過m5C MeRIP-seq和RNA-seq等分析揭示了NSUN2/SRSF6/UAP1信號軸在ATC耐藥性中的作用機制，為開發新的治療策略提供了理論依據。NSUN2抑制劑與現有抗癌藥物的聯合使用有望成為克服ATC耐藥性的新方法。未來的研究需要進一步評估NSUN2抑制劑的安全性和有效性，并探索其在其他腫瘤類型中的潛在應用。
m5C MeRIP-seq在本研究中的重要作用
本研究的m5C MeRIP-seq（甲基化RNA免疫沉淀測序）主要用于揭示NSUN2在甲狀腺未分化癌（ATC）中的作用機制，主要表現在：
（1）鑒定m5C修飾的靶基因：通過MeRIP-seq技術能夠系統地分析NSUN2在ATC細胞中對mRNA的m5C修飾情況。研究發現，NSUN2能夠特異性地修飾SRSF6 mRNA上的m5C位點。這一發現為后續研究NSUN2如何通過m5C修飾調控基因表達提供了直接證據。
（2）揭示m5C修飾的功能：MeRIP-seq分析顯示，NSUN2介導的m5C修飾能夠調節SRSF6 mRNA的細胞核質轉運。具體來說，m5C修飾增強了SRSF6 mRNA從細胞核向細胞質的轉運，從而促進了SRSF6蛋白的表達。這一過程對于ATC細胞的多藥耐藥性（MDR）至關重要。
（3）探索m5C修飾的調控機制：研究中通過MeRIP-seq結合其他實驗手段（如RNA下拉實驗和RIP-qPCR），揭示了ALYREF作為m5C修飾的“reader”，能夠鑒定并結合m5C修飾的SRSF6 mRNA，并將其從細胞核轉運到細胞質。這一發現進一步完善了m5C修飾在基因表達調控中的分子機制。
（4）驗證m5C修飾的生物學意義：通過比較NSUN2敲除細胞與野生型細胞的MeRIP-seq數據，研究人員發現NSUN2敲除后SRSF6 mRNA的m5C修飾水平顯著下降，同時SRSF6蛋白表達也受到抑制。這表明m5C修飾在維持SRSF6功能和ATC細胞耐藥性中發揮著重要作用。
參考文獻：
Hou X, Dong Q, Hao J, Liu M, Ning J, Tao M, Wang Z, Guo F, Huang D, Shi X, Gao M, Li D, Zheng X. NSUN2-mediated m5C modification drives alternative splicing reprogramming and promotes multidrug resistance in anaplastic thyroid cancer through the NSUN2/SRSF6/UAP1 signaling axis. Theranostics 2025; 15(7):2757-2777. doi:10.7150/thno.104713.
近日，天津醫科大學腫瘤醫院鄭向前教授團隊以甲狀腺未分化癌（ATC）為研究對象，利用m5C MeRIP-seq等技術揭示了NSUN2介導的m5C修飾在ATC耐藥性中的作用機制，闡明了NSUN2/SRSF6/UAP1信號軸在ATC多藥耐藥性（Multidrug Resistance, MDR）中的關鍵作用，并提出通過小分子NSUN2抑制劑克服耐藥性的新策略。這一發現不僅為ATC的治療提供了新的靶點，也為理解RNA修飾在腫瘤耐藥性中的作用提供了重要依據。相關研究成果以《NSUN2-mediated m5C modification drives alternative splicing reprogramming and promotes multidrug resistance in anaplastic thyroid cancer through the NSUN2/SRSF6/UAP1 signaling axis》為題發表于《Theranostics》雜志。
標題：NSUN2-mediated m5C modification drives alternative splicing reprogramming and promotes multidrug resistance in anaplastic thyroid cancer through the NSUN2/SRSF6/UAP1 signaling axis（NSUN2介導的m5C修飾通過NSUN2/SRSF6/UAP1信號軸驅動可變剪切重編程并促進甲狀腺未分化癌的多藥耐藥性）
發表時間：2025-1-27
發表期刊：Theranostics
影響因子：IF 12.4/Q1
技術平臺：MeRIP-seq、scRNA-seq、bulk RNA-seq（易基因金牌技術）
本研究通過對ATC樣本的bulk轉錄組（bulk RNA-seq）和單細胞RNA測序（scRNA-seq）數據進行全面分析，以篩選與多藥耐藥性（MDR）相關的m5C修飾基因。隨后進行IC50實驗、流式細胞術分析，并利用Nsun2基因敲除的自發性甲狀腺癌（spontaneous tumorigenic ATC）小鼠模型，證明了NSUN2在ATC中促進MDR的作用。為了探究NSUN2介導的耐藥機制，研究構建了NSUN2基因敲除的ATC細胞系，并進行轉錄組學、蛋白質組學和MeRIP-seq分析。此外還通過RNA-seq測序和可變剪切(alternative splicing，AS)分析，研究NSUN2敲除后的整體變化。進一步通過糖蛋白染色、變性免疫沉淀泛素化、核質分離和PCR等方法，探討了NSUN2/SRSF6/UAP1軸的潛在機制。最后在體外和體內評估了小分子NSUN2抑制劑與抗癌藥物的協同效應。
研究結果表明，NSUN2表達與ATC中的MDR顯著相關。NSUN2作為m5C的“writer”，ALYREF作為“reader”，它們共同作用于SRSF6 mRNA，誘導可變剪切重編程，并將UAP1基因的剪接形式從AGX1轉向AGX2。結果表明，AGX2增強了ABC轉運蛋白的N-糖基化，通過抑制泛素化介導的降解以穩定這些蛋白。NSUN2抑制劑通過降低NSUN2酶活性并減少下游靶標表達，為克服ATC中的MDR提供了一種新的、有前景的治療策略。
本研究揭示了NSUN2/SRSF6/UAP1信號軸在ATC的MDR中的關鍵作用，并確定了NSUN2作為化療和靶向治療的協同靶點。
研究摘要
研究方法
生物信息學分析：通過分析ATC樣本的bulk RNA-seq測序數據，篩選與MDR相關的m5C修飾基因。
細胞實驗和分子機制研究：利用CRISPR/Cas9技術構建NSUN2基因敲除（knockout）的ATC細胞系，通過RNA-seq、蛋白質組學和MeRIP-seq分析等技術研究NSUN2的功能。
動物模型：構建Nsun2基因敲除的自發性甲狀腺癌小鼠模型，評估NSUN2體內對MDR影響。
藥物敏感性分析：通過IC50實驗和流式細胞術檢測NSUN2抑制劑與抗癌藥物的聯合效應。
研究結果
（1）生物信息學分析揭示ATC中NSUN2和多藥耐藥性（MDR）之間的相關性
通過分析Cancer Therapeutics Response Portal（CTRP）數據庫中的藥物敏感性數據，發現NSUN2的表達與多種抗癌藥物（包括化療藥物和酪氨酸激酶抑制劑）的IC50值呈正相關。
利用GEO數據庫中的ATC轉錄組數據，將患者分為高NSUN2表達組和低NSUN2表達組，發現高NSUN2表達與細胞分裂、有絲分裂、細胞周期等化療靶向過程相關。
scRNA-seq測序分析顯示，NSUN2在ATC細胞中的表達與多種化療藥物和TKI的耐藥性相關。
圖1：生物信息學分析揭示NSUN2與ATC中多藥耐藥性（MDR）的相關性。
B-C）高NSUN2表達組與低NSUN2表達組之間差異表達基因（DEGs）的富集通路總結。
D）ATC的scRNA-seq數據的tSNE圖，展示了鑒定出的細胞clusters（n=10）。
E）散點圖顯示NSUN2陽性細胞與NSUN2陰性細胞的log2倍變化（log2FC）及其與每種藥物預測的IC50曲線下面積（AUC）值的相關性。
F）蝴蝶圖展示NSUN2表達、藥物敏感性與基因本體（GO）通路分析之間的相關性。
G）ATC的scRNA-seq數據的tSNE圖，展示了鑒定出的細胞clusters（n=10）。
H）使用Beyondcell對GEO數據集樣本進行的單細胞藥物敏感性分析。
I）NSUN2表達與Beyondcell評分之間的相關性。
（2）ATC中NSUN2誘導的MDR取決于其甲基轉移酶活性
在ATC細胞系中敲低或敲除NSUN2后，細胞對多種藥物的敏感性顯著增加，表明NSUN2表達與MDR密切相關。
通過構建NSUN2催化活性突變體（C271A），發現只有野生型NSUN2能夠恢復m5C修飾活性和藥物耐受性，表明NSUN2的甲基轉移酶活性是其誘導MDR的關鍵。
圖2：ATC中由NSUN2誘導的MDR依賴于其甲基轉移酶活性。
A）通過Western blot分析檢測Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后的NSUN2蛋白表達情況。B）通過點雜交實驗檢測NSUN2基因敲除對Cal-62細胞mRNA轉錄組中m5C水平的影響。
C）通過比色法m5C定量實驗確認NSUN2基因敲除后Cal-62細胞中m5C水平的變化。
D-F）通過細胞生長抑制實驗評估NSUN2基因敲除對Cal-62細胞對多柔比星（doxorubicin）、順鉑（cisplatin）和侖伐替尼（lenvatinib）敏感性的影響。
G）通過Western blot分析檢測Cal-62細胞經不同處理后NSUN2蛋白的相對表達量。
H）通過點雜交實驗檢測經載體處理后Cal-62細胞mRNA轉錄組中m5C豐度。
I）通過比色法m5C定量實驗確認經處理后Cal-62細胞中m5C水平變化。
J-L）通過細胞生長抑制實驗評估經不同載體轉染的Cal-62細胞的IC50值。
M）自發性ATC小鼠模型的構建方案，包括靶向策略（左）和繁殖方案（右）。
N）小鼠基因分型結果，其中TPO-cre的DNA凝膠條帶大小為130/324bp，BrafV600E為185/307bp，Trp53flox/flox為290/370bp，Nsun2flox/flox為151/212bp。
O）在基因工程小鼠中多柔比星、順鉑和侖伐替尼的給藥方案。mATC（小鼠甲狀腺未分化癌）。
P）散點圖顯示各組小鼠的最終腫瘤重量。
Q）散點圖顯示各組小鼠的最終腫瘤體積。
R）顯示各組ATC小鼠的生存曲線。
（3）在ATC中，NSUN2介導的m5C修飾通過靶向SRSF6驅動可變剪切重編程
蛋白質組學分析顯示，NSUN2敲除后，與RNA剪接相關的蛋白表達發生顯著變化，其中SRSF6蛋白表達顯著下調，而其mRNA水平不變。
MeRIP-seq和qPCR結果表明，NSUN2通過m5C修飾調節SRSF6 mRNA的核質轉運，進而影響其蛋白表達。
通過突變SRSF6 mRNA上的m5C修飾位點，發現這些位點對SRSF6的核質轉運至關重要。
圖3：ATC中，NSUN2介導的m5C修飾通過靶向SRSF6驅動可變剪切重編程。
A）通過TMT-MS檢測的Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后蛋白水平變化的火山圖。B）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后TMT-MS數據的GO富集分析。
C）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后差異剪接基因的百分比剪接包含（ΔPSI）的火山圖。
D）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后顯著ΔPSI變化的小提琴圖。
E）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后SF3A/B、U2AF核心復合體和hnRNP家族中DEG熱圖。
F）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后TMT-MS數據中SRSF6蛋白水平的統計分析。
G）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后指示蛋白的Western blot分析。
H）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后SRSF6基因座周圍的MeRIP-seq數據的IGV軌跡圖。
I）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后SRSF6 mRNA中m5C富集的MeRIP-qPCR檢測。
J）經指示載體處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA中m5C富集的MeRIP-qPCR分析。
K）NSUN2基因敲除后Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質分布qRT-PCR分析。
L）經指示載體處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質分布。
M）經指示載體處理的Cal-62細胞中指示蛋白的Western blot分析。
N）SRSF6中的典型m5C結合位點。頂部為m5C結合位點的motif序列；底部為SRSF6中鑒定的m5C位點。
O）經指示載體處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA中m5C富集的MeRIP-qPCR定量。
P）經指示載體處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質分布。
（4）NSUN2通過增強ABC轉運蛋白的N-糖基化促進ATC中的MDR
轉錄組分析和KEGG通路分析顯示，NSUN2參與N-糖鏈生物合成過程。
通過糖蛋白染色和蛋白質印跡分析，發現NSUN2敲除后，ABC轉運蛋白（ABCC1和ABCG2）的N-糖基化水平降低，蛋白穩定性下降。
流式細胞術檢測顯示，NSUN2敲除細胞對藥物攝取增加，表明藥物外排減少，耐藥性降低。
圖4：NSUN2通過增強ABC轉運蛋白的N-糖基化促進ATC中的MDR。
A）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后轉錄數據的GO富集分析。B-C）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后轉錄數據的基因集富集分析（GSEA）。
D）總蛋白的考馬斯亮藍染色（左），NSUN2基因敲除后Cal-62細胞的糖蛋白染色結果（右）。
E-F）經或未經TM（tunicamycin）、SS（swainsonine）處理的Cal-62細胞中指示蛋白水平的Western blot分析。細胞裂解樣本經或未經PNGase F處理。“G”表示N-糖基化，“DG”表示N-糖基化減少。
G）NSUN2基因敲除的Cal-62細胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
H）代表性免疫組化（IHC）圖像顯示35例ATC組織中NSUN2、ABCG2和ABCC1的表達情況。
I-J）采用卡方檢驗分析NSUN2與ABCG2或ABCC1表達之間的相關性。
K-L）NSUN2與ABCG2或ABCC1的IHC評分的相關性分析。
M-N）使用NetNglyc服務器預測的ABCG2和ABCC1的潛在N-糖基化天冬酰胺位點。
O-P）分別在轉染了N557Q、N388Q、N596Q或N71Q、N19Q、N310Q、N(71+310)Q突變質粒的Cal-62細胞中，通過Western blot檢測ABCG2和ABCC1的表達情況。
Q-S）NSUN2基因敲除后Cal-62細胞中多柔比星、順鉑和侖伐替尼的細胞內積累情況的流式細胞儀分析。右側顯示平均熒光強度的定量結果。
（5）NSUN2通過N-糖基化增強ABC轉運蛋白的穩定性
通過western blot 分析和泛素化實驗，發現NSUN2敲除后，ABCC1和ABCG2的泛素化水平增加，表明N-糖基化缺失導致這些蛋白更容易被降解。
使用蛋白酶體抑制劑MG132可以部分恢復ABCC1和ABCG2的蛋白水平，進一步證實了N-糖基化對蛋白穩定性的影響。
圖5：NSUN2通過N-糖基化增強ABC轉運蛋白的穩定性。
A）Cal-62細胞經TM或不同濃度的MG132處理后，使用指定抗體進行Western blot分析。B）NSUN2基因敲除的Cal-62細胞經不同濃度的MG132處理后，使用指定抗體進行Western blot分析。
C）經TM和MG132處理的Cal-62細胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
D）使用ImageJ軟件對ABCC1和ABCG2蛋白水平進行定量分析。
E-F）經TM和MG132處理的Cal-62細胞進行ABCC1或ABCG2免疫沉淀（IP），隨后使用抗泛素抗體進行Western blot分析。
G）NSUN2基因敲除且經MG132處理的Cal-62細胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
H）使用ImageJ軟件對ABCC1和ABCG2蛋白強度進行定量分析。
I-J）NSUN2基因敲除且經MG132處理的Cal-62細胞進行ABCC1或ABCG2免疫沉淀（IP），隨后使用抗泛素抗體進行Western blot分析。
K-L）在Cal-62細胞中表達的野生型（WT）或指示的ABCG2/ABCC1突變體經125μg/mL環己酰亞胺（CHX）處理特定時間間隔后，通過Western blot進行分析。
M-N）使用ImageJ軟件對ABCG2或ABCC1的蛋白強度定量分析，并以β-Actin水平歸一化。
（6）NSUN2通過介導UAP1到SRSF6的可變剪切來促進N-糖基化
UAP1是N-糖基化反應中UDP-GlcNAc合成的關鍵酶，其有兩種亞型（AGX1和AGX2）。
NSUN2敲除后，UAP1的剪接形式從AGX2轉變為AGX1，導致N-糖基化活性降低。
通過過表達SRSF6，可以逆轉這一剪接變化，恢復N-糖基化水平和藥物耐受性。
圖6：NSUN2通過SRSF6介導UAP1的可變剪切促進N-糖基化。
A）UAP1促進UDP-GlcNAc的生物合成，UDP-GlcNAc是糖基化反應中的關鍵供體，尤其在N-糖基化和O-GlcNAc修飾中。B）Sashimi圖顯示NSUN2基因敲除后Cal-62細胞中UAP1剪切事件的變化。
C）對照組與NSUN2基因敲除的Cal-62細胞中UAP1剪切的RT-PCR分析。
D）自發性小鼠ATC腫瘤中UAP1的剪切事件的RT-PCR，有或沒有Nsun2基因敲除。
E）經指示載體處理的Cal-62細胞中UAP1剪切事件的RT-PCR（上圖）。Western blot分析了SRSF6重建（下圖）。
F）檢測總蛋白的考馬斯亮藍染色（左）。經指示載體處理的Cal-62細胞糖蛋白染色（右）。
G）經指示載體處理的Cal-62細胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
H-J）經指示載體處理的Cal-62細胞中多柔比星、順鉑和侖伐替尼的細胞內積累情況的流式細胞儀分析。右側顯示了平均熒光強度的定量結果。
K-M）指示載體處理Cal-62細胞對多柔比星、順鉑和侖伐替尼敏感影響細胞生長抑制實驗。
N-P）指示載體處理Cal-62細胞對多柔比星、順鉑和侖伐替尼反應影響的腫瘤生長曲線。
Q-S）指示載體處理Cal-62細胞對多柔比星、順鉑和侖伐替尼反應影響腫瘤最終重量。
（7）作為m5C的“reader”， ALYREF可以鑒定SRSF6并將其從細胞核轉運至細胞質
通過RNA免疫沉淀（RIP）和RNA下拉實驗，發現ALYREF能夠直接結合m5C修飾的SRSF6 mRNA，并將其從細胞核轉運至細胞質。
ALYREF的K171A突變體顯著降低對m5C -SRSF6結合能力，表明ALYREF是m5C修飾的“reader”。
ALYREF敲低或過表達可以調控SRSF6的細胞核質轉運和蛋白表達，進而影響藥物耐受性。
圖7：ALYREF作為m5C “reader”，能夠鑒定并介導SRSF6從細胞核到細胞質的轉運。
A-B）GSEA分析表明ALYREF的表達與化療耐藥性相關。C）熱圖顯示在NSUN2基因敲除或ALYREF、YBX1和SRSF2基因敲低的Cal-62細胞中與多柔比星和順鉑耐藥性相關的基因。
D）通過RIP-qPCR檢測ALYREF與Cal-62細胞中SRSF6的結合。
E）通過Western blot分析從SRSF6（m5C）下拉實驗中獲得的指示蛋白。
F）通過RIP-qPCR比較在經指示載體處理的Cal-62細胞中，野生型ALYREF（ALYREF-WT）和K171A突變型ALYREF（ALYREF-K171A）與SRSF6的結合。
G）通過RIP-qPCR評估NSUN2基因敲除后Cal-62細胞中ALYREF與SRSF6 mRNA的結合。
H）通過RIP-qPCR評估經指示載體處理的Cal-62細胞中ALYREF與SRSF6 mRNA的結合。
I）通過qRT-PCR實驗評估ALYREF基因敲低的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質分布。
J）在過表達ALYREF或ALYREF-K171A突變體的Cal-62細胞中，SRSF6 mRNA的核質分布。
K）經指示載體處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質分布。
L-N）細胞生長抑制實驗評估指示載體處理對Cal-62細胞對多柔比星、順鉑和侖伐替尼反應的影響。
O）通過Western blot分析經指示載體處理的Cal-62細胞中指示蛋白的水平。
P）NSUN2基因敲除的Cal-62細胞中ALYREF的免疫熒光染色（左側）以及核/質ALYREF分布的定量分析（右側）。
Q）通過Western blot分析（左側）以及相應的定量分析（右側），展示對照組和NSUN2基因敲除的Cal-62細胞中核和質ALYREF的水平，PARP1和TUBULIN分別作為核和質標記。
（8）小分子NSUN2抑制劑增強ATC中多藥敏感性
設計并合成小分子NSUN2抑制劑（NSUN2i），能夠顯著降低ATC細胞中的m5C水平。
NSUN2i處理后，SRSF6的核質轉運受阻，UAP1剪接形式改變，N-糖基化水平降低，ABC轉運蛋白穩定性下降。
體外實驗和動物模型實驗均顯示，NSUN2i與化療藥物或TKI聯合使用可以顯著增強藥物的抗腫瘤效果。
圖8：小分子NSUN2抑制劑增強ATC對多藥的敏感性。
A）通過點雜交實驗評估NSUN2基因敲除的經或未經NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞中mRNA的m5C水平。B）基于RT-qPCR的MeRIP檢測NSUN2基因敲除的經或未經NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的m5C富集分析。
C）通過qRT-PCR實驗評估NSUN2基因敲除的經或未經NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質分布。
D）通過Western blot分析NSUN2基因敲除的經或未經NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞中指示蛋白的水平。
E）RT-PCR顯示經或未經NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞和ACT-1細胞中UAP1的剪接事件。
F）檢測總蛋白的考馬斯亮藍染色（左），經或未經NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞和ACT-1細胞的糖蛋白染色（右）。
G）通過Western blot分析經或未經NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞和ACT-1細胞中指示蛋白的水平。
H-J）通過流式細胞儀分析經或未經NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞中多柔比星、順鉑和侖伐替尼的細胞內積累情況。右側顯示平均熒光強度的定量結果。
K-M）細胞生長抑制實驗評估NSUN2抑制劑與多柔比星、順鉑或侖伐替尼聯合使用對Cal-62細胞的影響。
N）展示在基因工程小鼠中NSUN2抑制劑、多柔比星、順鉑和侖伐替尼的給藥方案示意圖。
O）散點圖顯示各組小鼠的最終腫瘤重量。
P）散點圖顯示各組小鼠的最終腫瘤體積。
Q）顯示各組ATC小鼠的生存曲線。
圖9：NSUN2在ATC多藥耐藥中的功能和機制示意圖模型。
討論和局限性
本研究揭示了NSUN2通過m5C修飾調節SRSF6的細胞核質轉運，進而影響UAP1剪切和N-糖基化水平，最終導致ATC耐藥性的機制。研究結果表明，NSUN2及其下游靶點是靶向ATC耐藥性的潛在治療靶點。
然而，NSUN2在正常細胞生理中也發揮重要作用，系統性抑制NSUN2可能會帶來安全性問題。此外，如何實現NSUN2抑制劑的腫瘤特異性遞送仍然是一個挑戰。
易小結
本研究通過m5C MeRIP-seq和RNA-seq等分析揭示了NSUN2/SRSF6/UAP1信號軸在ATC耐藥性中的作用機制，為開發新的治療策略提供了理論依據。NSUN2抑制劑與現有抗癌藥物的聯合使用有望成為克服ATC耐藥性的新方法。未來的研究需要進一步評估NSUN2抑制劑的安全性和有效性，并探索其在其他腫瘤類型中的潛在應用。
m5C MeRIP-seq在本研究中的重要作用
本研究的m5C MeRIP-seq（甲基化RNA免疫沉淀測序）主要用于揭示NSUN2在甲狀腺未分化癌（ATC）中的作用機制，主要表現在：
（1）鑒定m5C修飾的靶基因：通過MeRIP-seq技術能夠系統地分析NSUN2在ATC細胞中對mRNA的m5C修飾情況。研究發現，NSUN2能夠特異性地修飾SRSF6 mRNA上的m5C位點。這一發現為后續研究NSUN2如何通過m5C修飾調控基因表達提供了直接證據。
（2）揭示m5C修飾的功能：MeRIP-seq分析顯示，NSUN2介導的m5C修飾能夠調節SRSF6 mRNA的細胞核質轉運。具體來說，m5C修飾增強了SRSF6 mRNA從細胞核向細胞質的轉運，從而促進了SRSF6蛋白的表達。這一過程對于ATC細胞的多藥耐藥性（MDR）至關重要。
（3）探索m5C修飾的調控機制：研究中通過MeRIP-seq結合其他實驗手段（如RNA下拉實驗和RIP-qPCR），揭示了ALYREF作為m5C修飾的“reader”，能夠鑒定并結合m5C修飾的SRSF6 mRNA，并將其從細胞核轉運到細胞質。這一發現進一步完善了m5C修飾在基因表達調控中的分子機制。
（4）驗證m5C修飾的生物學意義：通過比較NSUN2敲除細胞與野生型細胞的MeRIP-seq數據，研究人員發現NSUN2敲除后SRSF6 mRNA的m5C修飾水平顯著下降，同時SRSF6蛋白表達也受到抑制。這表明m5C修飾在維持SRSF6功能和ATC細胞耐藥性中發揮著重要作用。
參考文獻：
Hou X, Dong Q, Hao J, Liu M, Ning J, Tao M, Wang Z, Guo F, Huang D, Shi X, Gao M, Li D, Zheng X. NSUN2-mediated m5C modification drives alternative splicing reprogramming and promotes multidrug resistance in anaplastic thyroid cancer through the NSUN2/SRSF6/UAP1 signaling axis. Theranostics 2025; 15(7):2757-2777. doi:10.7150/thno.104713.
標簽：
RNA甲基化
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