用高分辨率熔解數據的內部標準校正雜合子檢測

摘要：

      背景：用于基因分型的高分辨率熔解曲線技術既簡單又有效。在以熔解為基礎的方法中，探針法是基因分型的黃金標準，可以將等位基因與目標的匹配完全區分開。小片段基因分型法是代替探針的基因分型法。異源雙鏈核酸分子的存在使得檢測純合子變得容易，其熔解峰的形狀有明顯的改變。純合子G/C或A/T的基因分型比較困難，因為其等位基因的Tm值相似。這些堿基對改變的純合子用小片段法很難區分。樣品間的溫度、buffer和體積的變化限制純合子的分離。不管儀器是多么精確，用戶操作的變化是需要注意的，減少這種變化的方法可以改進小片段基因分型。利用內部特定反應的標準可以克服這些限制。
      方法：合成校準的核苷酸，與其互補鏈的濃度相同。用普通PCR儀進行PCR反應，反應時有LC Green和內標的存在。PCR反應之后，將其放入LightSanner中，掃描55℃-97℃范圍內的數據。標準品熔解的特征是成一條線的，用于轉換每個樣品的熒光數據。測序之后確認基因型。我們通過測量每個樣品的峰形與基因型一致的平均Tm值的距離，評估較正之前和之后純合子基因分型的錯誤率。 當樣品的Tm值與不正確分組平均Tm值相近時，可以觀測到錯誤。
      結果：通過掃描大量的樣品板及PCR目標校準，使得堿基對SNP突變的基因分型敏感性從90%增至99%。校準之后，Tm標準差從0.056降至0.027℃。
      結論：在小擴增子內用溫度內標可以改進G/C和T/A的堿基改變的基因分型。此工作由美國國立衛生研究院的R44DK069106和R44HD053215到SFD和R42GM072419和R42GM073396到CTW資助。

背景：
      由于核苷酸的遺傳性能，變性或熔解，基因型之間的特征是多樣性的。以探針為基礎的基因分型有相當大的特定等位基因溫度偏移——幾攝氏度的優勢。高分辨率提供全部雙鏈轉換的詳細的圖，使排除探針法變得可能。另外，檢測全部擴增時，可以獲得每個實驗堿基數目的密度達到20倍的。盡管如此，因為潛在的相似的熔解溫度和熔解形狀，探針系統檢測純合子是比較困難的。小片段法提供一種簡單的基因分型解決方案。

方法：
       PCR反應體系為10ul，包括1×Lightsanner高敏感性基因分型的matermix（Idaho Technology），包括熱啟動酶，Mg2+，buffer及其它組分，核酸內標提供獨立于PCR的大約在62℃和92℃的熔解曲線。引物包括0.10或0.15um， 人類基因組DNA10-15ng。 PCR反應條件如下：95℃變性2min， 1個循環；94℃ 30s， 63℃-67℃（取決于實驗） 30s， 45個循環，結合了退火和延伸。最終的退火步驟是28℃,30s。用探針法分析所有的DNA樣品進行基因分型。
      在LightScanner96(Idaho Technology)上進行掃描，收集數據，溫度范圍為：55℃-97℃。熔解數據通過平滑曲線尺校準之后接近熒光數據。其次，每一個內標存在的Tm值是通過樣條數據代數的差值頂點來計算的，應用偏移和直線標尺因素排列每個校準。這個移動過程排列擴增子的熔解曲線，使最小化變小。數據用三次仿樣函數曲線尺重新取樣，用Lightsanner軟件進行分析。分析擴增子Tm值周圍的溫度范圍（用/不用提前校準好的內標），顯示派生峰。

結果：
        圖1顯示的是校正之前的完整的熔解峰顯示。 從低溫和高溫內標及擴增子熔解的中部區分熔解信號。

圖1：派生熔解曲線顯示校準和擴增子的熔解峰。左邊和右邊的峰是校準內標的峰。94的熔解剖面圖，接近76℃，從獨立的PCR反應中生成。校準分子沒有對其，純合子的擴增峰沒有清楚的分開。中部最窄且高的峰是CPS1A/T多態的A/A（藍色）和T/T（紅色）純合子基因型。添加的顏色以以前探針基因分型為基礎，并不是以小片段基因分型數據為基礎。較寬的中間峰形成A/T雜合子。在這個插圖，顯示放大峰的頂端。

圖2： 用內標改進的派生熔解峰。在板子上顯示熒光信號，板子包括了94個獨立的關于CPS1、OTC、MSH2和PAH變化的PCR反應。CPS1雙峰雜合子在校準之前就很容易區分（圖2a）。相反，OTC雜合子（圖2c）只顯示了一個明顯的峰，在校準之前很難決定。分析內標數據可以容易的確定基因型，在復制反應中可以清楚的觀察到不同的基因型。  

表1：從4塊板中的1塊復制板對比每個目的基因校準前和校準后的Tm值分離。就一切情況而論，校準后Tm值變低。可以從校準后低的標準差和非交叉范圍看出。
表1： 每個擴增板包括同樣集合的47個基因組DNA樣本（94個獨立的PCR反應）。以臨近參數為基礎，列出所有純合子的預測的Tm值。雜合子的Tm值沒有包括在內，因為他們是，一般而言，在我們系統中可以不用內標就可以基因分型。觀察值的Tm值比理論值高于5-7℃。 在某種程度上，LC Green染料可以使DNA:DNA雜合更穩定。雖然，沒有內標的基因型分類是比較粗糙的，未校準的和校準之后的平均Tm值明顯不同（p<0.001，非參數，U檢驗法）。
      CPS1和OTC PCR產物，臨近分析預測純合T/T和A/A擴增子的Tm相同。但是，對于兩個目的基因，兩個純合子組之間的平均Tms是不同的，即使沒有經過校正。盡管如此，校正T/T和A/A純合子之間的重疊之前，如圖示Tm值的范圍。校正之后，T/T和A/A純合子之間無重疊，顯示基因型分離。MSH2和PAH小片段產物，臨近分析預測包括純合子之一的擴增子之間Tm值有微小的不同。在校準之前分析兩種變化顯示粗糙的基因分型。校正之后，確定純合子的類型。表2顯示的是純合基因型的錯誤稱呼。

表2：經驗數據顯示校正敏感性的效果。敏感性本質的改進可以在校正數據中顯示。錯誤稱呼以相近的Tm值為基礎，不是文章中解釋的Lightsanner軟件稱呼。圖示每個小的目的片段擴增子生成的誤稱預測。
*沒有指定OTC T/A的rs數目。

軟件自動稱呼
      隨后的工作考慮到Lightsanner商業軟件之內運算法則發展，自動分配樣品到相似形狀的組，這種以形狀為基礎的基因分型不需要已知Tm值。在一個喜歡的方式以Tm值為基礎證實基因型之前，這種以形狀為基礎的稱呼得益于校正。圖3顯示的是改進掃描CPS1小擴增子產物的板的結果。

圖3：校準改善Lightsanner商業軟件自動化軟件稱呼。每個屏幕截圖在上部顯示校正熔解曲線，在下部顯示不同的平面圖。此外，可以看到分組情況。屏幕截圖左上部圖中的紅色、藍色和灰色應該重復模仿1-6列與7-12列的對比。在這個資料組中，我們在校準之前獲得敏感性是92%，校準之后的敏感性是100%。

校準減少Tm值反應體積的依賴
      預期Tm值依賴反應體積，因為96孔板的孔中更多的熱質量，包含了更多的mastermix或礦物油阻擋熱量轉移。這對升高表面Tm值有影響。我們用OTC 小擴增子檢測在mastermix體積之上的Tm依賴性，體積在7.0-12.5ul之間以0.5ul增量增加（儀器廠商推薦10ul），Tm值的依賴性在校正之前是牢固的（slope=+0.069,R2=0.798），但是校正之后就不一樣了（slope=-0.001,R2=0.066）（如圖4）。體積不同Tm值不同的效果用校準器有效的排除。

圖4： 在校準之前和之后Mastermix體積變化對Tm值的影響。擴增47個樣本，評估OTC基因c.299-8T>A變化。準備好的PCR反應液包括1ul模板DNA，體積變化的Mastermix，從7.5至12.5ul，每步增加0.5ul。 板A顯示的是校正之前的熔解，有明顯的變化。板B顯示的校正之后的熔解，減少了變化。板C顯示的是校正之前Tm值對Mastermix體積的的依賴性，掃描了反應的35個T/T純合子樣品。校正之后，可以觀察到兩件事情：1）壓縮誤差線，指示減少變化。2）斜率和R2值明顯減少，顯示Tm值與Mastermix之間的小的關系。與每個反應體積相對應的樣品分布在板的一些地方，清除了依賴于板的位置的依賴性。

結論
      小片段熔解是一種簡單的基因分型方法，不需要后續PCR操作。因為一些原因，小的擴增子適合基因分型。但是，沒有校正也可以成功區分純合子基因型，這不僅取決于采集的高分辨率熔解數據，也與樣品之間的buffer、體積和抽提的一致性有關。校準器有效的去除了很多混雜變量。授給較好的，相對穩定的可以測量的、附隨的更好的純合子基因分型。