利用LightScanner上的高分辨熔解曲線進行DNA甲基化位點檢測的靈敏性

引言

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳CpG二核苷酸修飾形式，異常的DNA甲基化模式發生在許多基因啟動子的CpG島，這會增加患癌癥的風險。CpG島高甲基化常導致基因沉默，與癌癥、老化、基因印記、X-染色體失活密切相關，此外，全基因組CpG高甲基化中也證實了發生在腫瘤形成的早期。傳統的檢測甲基化位點的方法是通過重亞硫酸鹽處理，處理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶轉變為胸腺嘧啶，然后進行直接測序。甲基化的胞嘧啶沒有發生改變，因此通過測序很容易識別。本研究中我們系統的評價了通過LightScanner的高分辨溶解曲線檢測甲基化的可靠性。如果這種方法在檢測甲基化中是可靠且靈敏度高，就可以減少測序的繁瑣過程。

未處理的和經過SssI處理的pBluescript II SK(+)質粒用Qiagen EpiTect試劑盒進行重亞硫酸鹽。通過對有代表性的區域進行測序，確保樣品完全甲基化以及亞硫酸鹽處理。引物設計在擴增片段大小在79-216bp的含有1-8個CpG位點的7個不同的片段。100%甲基化的和未甲基化的樣品按50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%的比例混合，100%甲基化的和未甲基化的樣品可以明顯的區分開。當兩個樣品按以上比例混合后，熔解曲線表現出重復的劑量放映關系，當50%混合時與未甲基化的標準品偏性最大。高分辨溶解曲線的靈敏度足夠檢測甲基化位點，對小片段的靈敏度可達到2%,大片段的可以10%。

重要的DNA甲基化位點顯示在B淋巴細胞增生性疾病，如慢性淋巴細胞白血病（CLL）中。瘤抑制基因的外部沉默可以通過DNA甲基化抑制劑處理而發生轉變。本研究中，CLL患者的miR-195基因CpG島上游甲基化位點用Vidaza或Cladribine處理，重亞硫酸鹽處理的CpG甲基化變化的最高的進行PCR擴增，之后用LightScanner進行高分辨溶解曲線分析。樣品經亞硫酸鹽處理后有不同的的胞嘧啶的轉換，然后通過單獨和混合后分析檢測的靈敏性。不同克隆之間只要有意個被保留的C就可以在異源或同源混合的樣品中區分開。這一結果證實了高分辨熔解曲線是檢測甲基化位點的簡單且靈敏度高的方法。

圖1：使用Sssl甲基化酶使2.9Kb的pBluescript CpG甲基化。甲基化的和非甲基化的樣品都使用Qiagen EpiTect Kit進行重亞硫酸鹽處理，之后進行PCR擴增，Lightscanner檢測，最后通過測序驗證。

圖1A：重亞硫酸鹽處理的100%甲基化的和100%非甲基化的四個片段。

圖1B：79-216bp的有2-8個CpG位點的甲基化的和非甲基化的片段進行不同比例的混合。對CpG較少的小片段的檢測的靈敏度在2%，有較多CpGs的大片段的檢測的靈敏度在10%。

圖1C：包含一個CpG位點的110bp，甲基化和非甲基化的樣品按不同比例混合。（8個重復）

圖2：甲基化抑制劑處理患者CpG島

下圖為用甲基抑制劑Vidaza或Cladribine處理前后microRNA195（269bp）的上游CpG島甲基化位點的變化

圖3：miR-195 CpG島的269bp擴增區

兩個不同的病人的CpG位點見下表

圖4：miR-195 CpG島的150bp擴增區

圖5：從4個CLL患者中克隆miR-195可能調控區，使用Qiagen EpiTect Kit進行重亞硫酸鹽處理，之后PCR擴增，Lightscanner檢測，測序。不同的患者采取不同的甲基化模式擴增（0-8 Cs）。熔解曲線是含有18 CpG位點的269bp的片段（A）和含有5 CpG位點的150bp的片段（B）。

圖6：等量混合不同患者的進行不同甲基化模式的克隆，并擴增了含有5CpG的150bp的片段。使用甲基抑制劑處理前后進行甲基化和未甲基化控制的比較，熔解曲線分別為患者P3（A），P4（B），V1（C），V3（D）。

圖7：甲基化的和非甲基化的DNA樣品按不同的比例混合，150bp的片段含有5和CpG位點。

總結

用不同的DNA甲基化模式來評價LightScanner 高分辨熔解曲線的能力。用質粒控制含100%甲基化的和未甲基化的部分表現出一定的劑量關系，50%混合后與未甲基化的偏離程度最大。分析結果證明對小片段的甲基化檢測的靈敏度在2%，大片段的靈敏度在10%。
在CLL分析中，經過甲基抑制劑處理后檢測患者miR-195基因CpG島的甲基化位點。不同克隆之間只要有意個被保留的C就可以在異源或同源混合的樣品中區分開。結論證實了使用高分辨溶解曲線是檢測甲基化位點簡單且靈敏的方法。