簡化甲基化測序RRBS在醫學、物種保護、農學應用領域的優勢及研究成果
本期我們通過3篇高分文章來解讀簡化甲基化測序（RRBS）技術優勢及研究成果（醫學+物種保護+農學）。
DNA甲基化是最早發現的基因表觀修飾方式之一，在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發育和腫瘤發生發展中起著重要作用，是目前及未來很長一段時間的研究熱點之一。DNA甲基化測序方法較多，研究者可以根據實驗目的選擇最佳的研究方案。如在研究調控區域甲基化狀態的應用場景中，RRBS就是最具性價比的方法之一。
關于RRBS
簡化甲基化測序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性內切酶對基因組進行酶切，富集啟動子及CpG島等重要的表觀調控區域并進行重亞硫酸鹽測序。該技術顯著提高了高CpG區域的測序深度，在CpG島、啟動子區域和增強子元件區域可以獲得高精度的分辨率，是一種準確、高效、經濟的DNA甲基化研究方法，在大規模臨床樣本的研究中具有廣泛的應用前景。
為了適應科研技術的需要，易基因進一步開發了可在更大區域內捕獲CpG位點的雙酶切RRBS(dRRBS)，可研究更廣泛區域的甲基化，包括CGI shore等區域。
為助力低樣本量多維度分析，易基因開發了富集覆蓋CpG島、啟動子、增強子、CTCF結合位點的甲基化靶向測序方法：extended-representation bisulfite sequencing（XRBS），實現了高靈敏度和樣本復用，使其具有高度可擴展性，并適用于有限的樣本和單個細胞。
技術優勢
精確度高：在其覆蓋范圍內可達到單堿基分辨率。
重復性好：多樣本的覆蓋區域重復性可達到85%-95%，適用多樣本間的差異分析。
性價比高：測序區域針對高CpG區域，數據利用率更高。
案例分析1：腸道功能鑒定（團隊文章）
RRBS揭示腸道對早產的快速適應涉及喂養相關的豬腸道基因DNA甲基化重編程
Gao F,et al. Rapid Gut Adaptation to Preterm Birth Involves Feeding-Related DNA Methylation Reprogramming of Intestinal Genes in Pigs. Front Immunol. 2020;11:565.
研究摘要：
早產后，未成熟的腸道功能和免疫功能必須迅速適應細菌定植和腸內喂養。作者為驗證腸道表觀遺傳變化與早產及首次喂養時的腸道反應有關，以仔豬為模型，對早產豬和足月豬進行全腸外營養（TPN）或部分腸內喂養5天，然后用牛奶進行純腸內喂養，直到第26天（斷奶年齡）。比較分析早產豬和足月豬在第0天、第5天和第26天的腸道結構、功能、微生物組、DNA甲基組和基因表達（每組n=8）。RRBS結果顯示，出生時早產豬腸道出現絨毛萎縮和整體高甲基化，影響與Wnt信號通路相關的基因。在生命的前5天，高甲基化相關的LBP（lipopolysaccharide binding protein）和TLR4（Toll-like receptor 4）通路基因表達明顯降低，但大多數早期甲基化差異在第26天消失。直到第26天，早產豬的蔗糖酶和麥芽糖酶活性仍然降低，腸道微生物群發生改變。0-5天期間顯示許多新的甲基化差異，主要表現在未提供腸內喂養（TPN喂養）的情況下。這些甲基化差異影響了與細胞代謝相關的腸道基因，包括通過啟動子低甲基化增加GCK（葡萄糖激酶）表達。總之，未成熟腸道在早產后可迅速適應其基因甲基化和表達的能力，只有少數早產相關缺陷會持續到斷奶。結果表明早期腸內喂養對于刺激腸道基因的甲基化重編程可能很重要，從而使腸道快速適應早產環境。
案例分析2：物種保護（團隊文章）
RRBS+RNA-seq揭示遷地保護金絲猴（Rhinopithecus roxellana）的表觀遺傳和轉錄特征
Du Zhang,et al. Epigenetic and transcriptional signatures of ex situ conserved golden snub-nosed monkeys (Rhinopithecus roxellana). Biological Conservation 237 (2019) 175–184
研究摘要：采集野生和圈養金絲猴的血液樣本，研究人員使用簡化甲基化RRBS和轉錄組RNA-seq進行測序分析，發現圈養組金絲猴的DNA甲基化和基因表達與野生組相比均存在顯著差異，這和人類圈養組金絲猴的特定食物供應和圈養環境與管理措施有關。KEGG通路分析顯示，差異表達基因在廣泛的生理功能通路中富集，且大部分與免疫和代謝功能相關，特別是自噬相關通路中的一組核心基因如ATP6V0A1和PPM1D均存在相關聯的差異DNA甲基化和基因表達。研究結果表明，遷地保護金絲猴對人類干預保護表現出明顯的表觀遺傳和轉錄適應，這一結果為未來生物標志物的開發提供基礎，表觀遺傳和轉錄特征或可用于瀕危動物物種遷地保護計劃中的風險評估。
案例分析3：動物育種
RRBS揭示不同孵化溫度和CO2濃度中的雞心臟組織全基因組DNA甲基化
Corbett RJ, et al. Genome-Wide Assessment of DNA Methylation in Chicken Cardiac Tissue Exposed to Different Incubation Temperatures and CO2 Levels. Front Genet. 2020;11:558189.
研究摘要：
孵化過程中的溫度和CO2濃度對肉雞的發育有著深遠的影響。此前許多研究發現這些參數的差異對孵化心重 (heart weight，HW) 有顯著影響。早期生活環境也被證明會影響肉雞后期的生產性能，因此表觀遺傳機制可能介導環境刺激引起的長期生理變化。作者利用RRBS技術評估84只在兩種不同蛋殼溫度（EST；37.8℃和38.9℃）和三種CO2濃度（0.1%、0.4%和0.8%）下孵化的肉雞幼體心臟組織的DNA甲基化模式，并進行差異甲基化分析。
研究結果驗證了ABLIM2、PITX2和THRSP三個基因的甲基化和表達的協調變化，確定孵化后小雞心臟的差異甲基化模式與孵化EST和CO2的差異有關，并且這種差異可能通過轉錄因子結合和基因表達的變化影響心臟的生長和發育。此外，本研究還鑒定了負責調節體溫的其他器官（包括下丘腦和甲狀腺）的表觀遺傳模式可能有助于表征調節心臟發育的溫度驅動差異機制。總之，對早期生活環境影響的表觀遺傳特征了解可以作為未來動物表現預測因子，從而有利于動物育種。
RRBS繪制DNA甲基化圖譜概述
參考文獻：
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2020.00565/full
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2020.558189/full
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0006320719302149?via%3Dihub
DNA甲基化是最早發現的基因表觀修飾方式之一，在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發育和腫瘤發生發展中起著重要作用，是目前及未來很長一段時間的研究熱點之一。DNA甲基化測序方法較多，研究者可以根據實驗目的選擇最佳的研究方案。如在研究調控區域甲基化狀態的應用場景中，RRBS就是最具性價比的方法之一。
關于RRBS
簡化甲基化測序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性內切酶對基因組進行酶切，富集啟動子及CpG島等重要的表觀調控區域并進行重亞硫酸鹽測序。該技術顯著提高了高CpG區域的測序深度，在CpG島、啟動子區域和增強子元件區域可以獲得高精度的分辨率，是一種準確、高效、經濟的DNA甲基化研究方法，在大規模臨床樣本的研究中具有廣泛的應用前景。
為了適應科研技術的需要，易基因進一步開發了可在更大區域內捕獲CpG位點的雙酶切RRBS(dRRBS)，可研究更廣泛區域的甲基化，包括CGI shore等區域。
為助力低樣本量多維度分析，易基因開發了富集覆蓋CpG島、啟動子、增強子、CTCF結合位點的甲基化靶向測序方法：extended-representation bisulfite sequencing（XRBS），實現了高靈敏度和樣本復用，使其具有高度可擴展性，并適用于有限的樣本和單個細胞。
技術優勢
精確度高：在其覆蓋范圍內可達到單堿基分辨率。
重復性好：多樣本的覆蓋區域重復性可達到85%-95%，適用多樣本間的差異分析。
性價比高：測序區域針對高CpG區域，數據利用率更高。
案例分析1：腸道功能鑒定（團隊文章）
RRBS揭示腸道對早產的快速適應涉及喂養相關的豬腸道基因DNA甲基化重編程
Gao F,et al. Rapid Gut Adaptation to Preterm Birth Involves Feeding-Related DNA Methylation Reprogramming of Intestinal Genes in Pigs. Front Immunol. 2020;11:565.
研究摘要：
早產后，未成熟的腸道功能和免疫功能必須迅速適應細菌定植和腸內喂養。作者為驗證腸道表觀遺傳變化與早產及首次喂養時的腸道反應有關，以仔豬為模型，對早產豬和足月豬進行全腸外營養（TPN）或部分腸內喂養5天，然后用牛奶進行純腸內喂養，直到第26天（斷奶年齡）。比較分析早產豬和足月豬在第0天、第5天和第26天的腸道結構、功能、微生物組、DNA甲基組和基因表達（每組n=8）。RRBS結果顯示，出生時早產豬腸道出現絨毛萎縮和整體高甲基化，影響與Wnt信號通路相關的基因。在生命的前5天，高甲基化相關的LBP（lipopolysaccharide binding protein）和TLR4（Toll-like receptor 4）通路基因表達明顯降低，但大多數早期甲基化差異在第26天消失。直到第26天，早產豬的蔗糖酶和麥芽糖酶活性仍然降低，腸道微生物群發生改變。0-5天期間顯示許多新的甲基化差異，主要表現在未提供腸內喂養（TPN喂養）的情況下。這些甲基化差異影響了與細胞代謝相關的腸道基因，包括通過啟動子低甲基化增加GCK（葡萄糖激酶）表達。總之，未成熟腸道在早產后可迅速適應其基因甲基化和表達的能力，只有少數早產相關缺陷會持續到斷奶。結果表明早期腸內喂養對于刺激腸道基因的甲基化重編程可能很重要，從而使腸道快速適應早產環境。
早產豬和足月豬腸道的甲基化差異
案例分析2：物種保護（團隊文章）
RRBS+RNA-seq揭示遷地保護金絲猴（Rhinopithecus roxellana）的表觀遺傳和轉錄特征
Du Zhang,et al. Epigenetic and transcriptional signatures of ex situ conserved golden snub-nosed monkeys (Rhinopithecus roxellana). Biological Conservation 237 (2019) 175–184
研究摘要：采集野生和圈養金絲猴的血液樣本，研究人員使用簡化甲基化RRBS和轉錄組RNA-seq進行測序分析，發現圈養組金絲猴的DNA甲基化和基因表達與野生組相比均存在顯著差異，這和人類圈養組金絲猴的特定食物供應和圈養環境與管理措施有關。KEGG通路分析顯示，差異表達基因在廣泛的生理功能通路中富集，且大部分與免疫和代謝功能相關，特別是自噬相關通路中的一組核心基因如ATP6V0A1和PPM1D均存在相關聯的差異DNA甲基化和基因表達。研究結果表明，遷地保護金絲猴對人類干預保護表現出明顯的表觀遺傳和轉錄適應，這一結果為未來生物標志物的開發提供基礎，表觀遺傳和轉錄特征或可用于瀕危動物物種遷地保護計劃中的風險評估。
DMR和DEG匯總
案例分析3：動物育種
RRBS揭示不同孵化溫度和CO2濃度中的雞心臟組織全基因組DNA甲基化
Corbett RJ, et al. Genome-Wide Assessment of DNA Methylation in Chicken Cardiac Tissue Exposed to Different Incubation Temperatures and CO2 Levels. Front Genet. 2020;11:558189.
研究摘要：
孵化過程中的溫度和CO2濃度對肉雞的發育有著深遠的影響。此前許多研究發現這些參數的差異對孵化心重 (heart weight，HW) 有顯著影響。早期生活環境也被證明會影響肉雞后期的生產性能，因此表觀遺傳機制可能介導環境刺激引起的長期生理變化。作者利用RRBS技術評估84只在兩種不同蛋殼溫度（EST；37.8℃和38.9℃）和三種CO2濃度（0.1%、0.4%和0.8%）下孵化的肉雞幼體心臟組織的DNA甲基化模式，并進行差異甲基化分析。
研究結果驗證了ABLIM2、PITX2和THRSP三個基因的甲基化和表達的協調變化，確定孵化后小雞心臟的差異甲基化模式與孵化EST和CO2的差異有關，并且這種差異可能通過轉錄因子結合和基因表達的變化影響心臟的生長和發育。此外，本研究還鑒定了負責調節體溫的其他器官（包括下丘腦和甲狀腺）的表觀遺傳模式可能有助于表征調節心臟發育的溫度驅動差異機制。總之，對早期生活環境影響的表觀遺傳特征了解可以作為未來動物表現預測因子，從而有利于動物育種。
RRBS繪制DNA甲基化圖譜概述參考文獻：
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2020.00565/full
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2020.558189/full
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0006320719302149?via%3Dihub
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