PCR反應引物二聚體詳細闡述
1、引物二聚體形成的原因
引物二聚體的形成是在實時熒光定量 PCR 設計和驗證過程中最常見的問題之一，當引物對之間的部分序列存在同源性時，可形成引物二聚體。如果在 PCR 反應過程中引物退火形成二聚體，則 TaqDNA 聚合酶可延伸二聚體，形成長于原始引物的產物，它可導致循環過程中更易出現退火錯誤。根據長度的不同，引物也可能出現自身折疊，由此與模板形成沖突。反應的復雜性 (尤其在多重反應過程中) 可使上述不良影響發生的幾率增加。
2、如何確定是否存在引物二聚體？
凝膠電泳是顯示引物二聚體的一種極佳的方法。如圖 1所示，引物二聚體在凝膠的底部形成擴散條帶，通常位100 bp 以下。在 PCR 過程中，二聚體的形成與模板的退火及延伸之間存在競爭作用。引物二聚體通常隨模板的減少而增加。單獨采用凝膠電泳分析進行驗證的缺點在于，其靈敏度最低僅達到納克級，因此可能無法得出結果。凝膠電泳分析的優勢是當解離曲線 (熔解曲線) 數據同時可用時，產物的大小有助于對結果進行綜合解釋。
圖1解離曲線，又稱熔解曲線，是利用雙鏈 DNA 結合染料獲得的標準反應熱廊線。如果擴增具有極好的特異性，則實時熒光定量 PCR 板上每個反應孔的解離曲線將出現一個較窄的單峰。引物二聚體的熒光強度較低，呈較寬的“波形”，顯示其在 70°C 左右熔解。出現此峰形和熔解溫度主要是由于引物二聚體的長度較小且不確定。若對解離曲線中是否存在引物二聚體有任何疑問，可將觀察的結果與 NTC（No Template Control，即無模板對照，是陰性對照）反應孔相比較，當模板不存在時，更易出現引物二聚體峰 (圖 2，熔解曲線中突出顯示了特異性擴增 (圖2A) 和引物二聚體效應(圖2B)。可利用 NTC 樣本在熔解曲線中產生多余的峰(圖2B) 識別出引物二聚體)。
3、如何減少或去除引物二聚體？
如果出現了引物二聚體，有許多方法可以減少或消除反應中的引物二聚體。
（1）、首先是優化熱循環條件，這主要是提高退火溫度。大多數情況下，兩步循環 (由 95°C 變性步驟直接進入60°C 退火和延伸步驟) 有利于強效擴增，因此引物設計時設定的成功退火溫度為 60°C。
（2）、可降低引物濃度，甚至采用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的幫助。大多數情況下，每條引物的理想最終濃度為 200 nM，但如有需要，可將濃度降至 60 nM。
（3）、鎂的最佳濃度一般約為 3 mM。高于此濃度易形成引物二聚體。
（4）、如果未對引物形成二聚體的傾向進行評估，則應補充評估并考慮重新設計 (如有需要)。通常情況下，最好使用熱啟動 DNA 聚合酶，并在冰上進行反應。
（5）、在理論上，針對同一靶點應同時檢測多個引物組。這實際上可以節省大量時間，因為如果這些引物中的一個能立即發揮作用，則可以減少花費在優化過程上的時間。
引物二聚體的形成是在實時熒光定量 PCR 設計和驗證過程中最常見的問題之一，當引物對之間的部分序列存在同源性時，可形成引物二聚體。如果在 PCR 反應過程中引物退火形成二聚體，則 TaqDNA 聚合酶可延伸二聚體，形成長于原始引物的產物，它可導致循環過程中更易出現退火錯誤。根據長度的不同，引物也可能出現自身折疊，由此與模板形成沖突。反應的復雜性 (尤其在多重反應過程中) 可使上述不良影響發生的幾率增加。
2、如何確定是否存在引物二聚體？
凝膠電泳是顯示引物二聚體的一種極佳的方法。如圖 1所示，引物二聚體在凝膠的底部形成擴散條帶，通常位100 bp 以下。在 PCR 過程中，二聚體的形成與模板的退火及延伸之間存在競爭作用。引物二聚體通常隨模板的減少而增加。單獨采用凝膠電泳分析進行驗證的缺點在于，其靈敏度最低僅達到納克級，因此可能無法得出結果。凝膠電泳分析的優勢是當解離曲線 (熔解曲線) 數據同時可用時，產物的大小有助于對結果進行綜合解釋。
圖1解離曲線，又稱熔解曲線，是利用雙鏈 DNA 結合染料獲得的標準反應熱廊線。如果擴增具有極好的特異性，則實時熒光定量 PCR 板上每個反應孔的解離曲線將出現一個較窄的單峰。引物二聚體的熒光強度較低，呈較寬的“波形”，顯示其在 70°C 左右熔解。出現此峰形和熔解溫度主要是由于引物二聚體的長度較小且不確定。若對解離曲線中是否存在引物二聚體有任何疑問，可將觀察的結果與 NTC（No Template Control，即無模板對照，是陰性對照）反應孔相比較，當模板不存在時，更易出現引物二聚體峰 (圖 2，熔解曲線中突出顯示了特異性擴增 (圖2A) 和引物二聚體效應(圖2B)。可利用 NTC 樣本在熔解曲線中產生多余的峰(圖2B) 識別出引物二聚體)。
3、如何減少或去除引物二聚體？
如果出現了引物二聚體，有許多方法可以減少或消除反應中的引物二聚體。
（1）、首先是優化熱循環條件，這主要是提高退火溫度。大多數情況下，兩步循環 (由 95°C 變性步驟直接進入60°C 退火和延伸步驟) 有利于強效擴增，因此引物設計時設定的成功退火溫度為 60°C。
（2）、可降低引物濃度，甚至采用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的幫助。大多數情況下，每條引物的理想最終濃度為 200 nM，但如有需要，可將濃度降至 60 nM。
（3）、鎂的最佳濃度一般約為 3 mM。高于此濃度易形成引物二聚體。
（4）、如果未對引物形成二聚體的傾向進行評估，則應補充評估并考慮重新設計 (如有需要)。通常情況下，最好使用熱啟動 DNA 聚合酶，并在冰上進行反應。
（5）、在理論上，針對同一靶點應同時檢測多個引物組。這實際上可以節省大量時間，因為如果這些引物中的一個能立即發揮作用，則可以減少花費在優化過程上的時間。
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