MicroRNAs (miRNAs)是一種大小約21—23個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關。據推測，這些非編碼小分子RNA（miRNAs）參與調控基因表達，但其機制區別于siRNA介導的mRNA降解。第一個被確認的miRNA是在線蟲中首次發現的lin-4 和let-7，隨后多個研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數百個miRNAs。

 

已經被鑒定的miRNAs據推測大都是由具有發夾結構、約70個堿基大小形成發夾結構的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成的，有5’端磷酸基和3’羥基，大小約21—25nt的小分子RNA片斷，定位于RNA前體的3’端或者5’端。

 

最近3個研究小組分別從線蟲、果蠅和Hela細胞中鑒定的100個新miRNAs中，有15%跨越線蟲、果蠅和哺乳動物基因組具有高度的保守性（只有有1—2個堿基的區別），Lau 和Bartel 實驗室的同事更加認為：所有的miRNAs可能在其他物種中具有直向同源物（Ortholog，指那些起源于同一祖先，在不同生物體中行使同一功能的基因群就可比作為一個門類，這些類似的基因被稱為“直向同源物”）。

 

Bantam 最早被認為是果蠅中參與細胞增殖的一個基因位點。已知幾個包含增強子的轉座子插入跨越這個位點的一段12.3kb區域會導致果蠅的眼和翅重復生長，而由轉座子介導的一段跨越該位點的23kb片斷缺失則導致突變果蠅個體小于野生型果蠅。Cohen和同事用一段3.85kb的片斷導入21kb片斷缺失的果蠅中使其恢復原來的大小。但是奇怪的是表達這個3.85kb片斷中的EST卻沒有同樣的效果。Cohen將這個片斷和瘧蚊Anopheles gambiae的同源序列進行比較，發現一段90bp的高度保守區，經過RNA folding program (mfold)發現這個保守序列可以形成發夾結構，使得這個區段很象是一個miRNA的前體。這個結果經過Northern blot證實突變果蠅的幼體缺少一個21bp的bantam miRNA ，用這個90bp的mRNA前體經過一系列的“功能缺失”—“功能恢復”實驗，證實 bantam miRNA在細胞增殖中的作用。研究人員用計算機程序檢索在hid mRNA的3’非編碼區找到了bantam的3個潛在的結合位點（ hid是果蠅中一個誘導凋亡的基因），并證實 bantam miRNA抑制hid 的翻譯而非轉錄。

 

miRNAs的表達方式各不相同。部分線蟲和果蠅的miRNA在各個發育階段的全部細胞中都有表達，而其他的miRNA則依據某種更為嚴謹的位相和時相的表達模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern）——在不同組織、不同發育階段中miRNA的水平有顯著差異。

 

對microRNAs (miRNAs)的研究正在不斷增加，原因是科學家開始認識到這些普遍存在的小分子在真核基因表達調控中有著廣泛的作用。在線蟲，果蠅，小鼠和人等物種中已經發現的數百個miRNAs中的多數具有和其他參與調控基因表達的分子一樣的特征——在不同組織、不同發育階段中miRNA的水平有顯著差異，這種miRNAs表達模式具有分化的位相性和時序性（ differential spatial and temporal expression patterns），提示miRNAs有可能作為參與調控基因表達的分子，因而具有重要意義。

 

第一個被確認的miRNA——在線蟲中首次發現的lin-4 和let-7，可以通過部分互補結合到目的mRNA靶的3’非編碼區(3’UTRs)，以一種未知方式誘發蛋白質翻譯抑制，進而抑制蛋白質合成，通過調控一組關鍵mRNAs的翻譯從而調控線蟲發育進程(reviewed in Pasquinelli 2002)。

 

bantam miRNA是第一個被發現有原癌基因作用的miRNA。除了lin-4、let-7，已知還有一些miRNAs可能參與在細胞分化和組織發育過程中起重要作用的基因的轉錄后調控，例如mir-14、mir-23 等。

 

在植物miRNAs的研究中有兩條線索提示miRNAs可能參與植物的發育過程。一是在carpel factory (car) 突變株中3個miRNAs的表達水平顯著下降。CARPEL FACTORY 是一個類似Dicer的酶，參與植物的發育，其缺失突變株表現為胚胎和葉片發育的缺陷。實驗結果提示這種缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。多數的植物miRNAs在某些特定組織中高水平表達也提示他們可能參與了植物組織的發育。

 

對一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs參與生命過程中一系列的重要進程，包括早期發育(Reinhart 2000)，細胞增殖，細胞凋亡，細胞死亡(Brennecke 2003），脂肪代謝（Xu 2003)和細胞分化(Kawasaki 2003)。此外，一個研究表明，2個miRNAs水平的下降和慢性淋巴細胞白血病之間的顯著相關，提示miRNAs和癌癥之間可能有潛在的關系(Calin 2002)。

 

由于miRNAs存在的廣泛性和多樣性，提示miRNAs可能有非常廣泛多樣的生物功能。盡管對miRNA的研究還處于初級階段，據推測miRNAs在高級真核生物體內對基因表達的調控作用可能和轉錄因子一樣重要。有一種看法是：miRNAs可能代表在一個新發現的層次上的基因表達調控方式。

 

然而，大多數miRNAs的功能仍然是個謎。

 

最早被發現的兩個miRNAs——lin-4 and let-7被認為是通過不完全互補結合到目標靶mRNA 3’非編碼區端，以一種未知方式誘發蛋白質翻譯抑制，進而抑制蛋白質合成，阻斷mRNA的翻譯。多個果蠅miRNAs也被發現和他們的目標靶mRNAs的3’非編碼區有部分同源。由于miRNAs和其潛在的目標靶之間并非完全互補，這使得通過信息學的方法鑒定miRNA的目標靶位點變得困難。因而也無法確定miRNAs的作用方式是什么，以何種機制影響mRNA的翻譯，以何種方式調控基因表達。miRNAs的作用目標靶和活性機制一直是各地的研究人員的關注熱點。

 

在植物中目前有一個miRNA和3個潛在的目標靶基因完全互補（這些scarecrow 基因編碼潛在的轉錄因子），盡管目前還不清楚這些基因是否就是miRNA的目標靶，這仍是第一次發現miRNA 和其潛在的目標靶完全互補，也提示miRNA可能包含和siRNA類似的作用方式。

 

多個研究小組采用生物化學結合是生物信息學的方法開展對miRNAs的研究工作。由于據推測都是由Dicer酶降解RNA得到的，21—23個堿基大小、有5’端磷酸基和3’羥基的RNA片斷，有的實驗室采用改良的定向克隆方法來篩選具有相同特征的小分子——篩選一定大小的RNA分子，連接到3’和5’的適配子（adapters），逆轉錄并通過PCR擴增、亞克隆并測序。miRNA前體在基因組上的定位和聚類是通過向基因組數據庫查詢進行。這個方法有助于判斷miRNAs是否是mRNAs、tRNAs、rRNAs等分子的降解產物。

 

有的實驗室通過一種RNA folding program ’mfold’  來判斷C. elegans 和C. briggsae 之間的高度保守區域是否含有潛在的miRNA前體，然后用Northern Blots的方法來確定這些miRNAs是否真的表達了。

 

盡管有數百個miRNAs通過生化或者是生物信息學的方法被鑒別出來，已經鑒別出來的miRNAs只不過是滄海一粟，由于很多已經鑒別出來的miRNAs是從單個克隆中鑒別出來的，所以可以假設還有很多miRNAs在分離和鑒定過程中被“漏掉”了，測序工作還遠遠不夠。

 

1) miRNA的計算機RNA組學方法

 

生物信息學方法是依據在不同的物種中，其成熟的miRNA 具有較大的序列同源性以及前體的莖環結構具有相當大的保守性這一特征在基因組數據庫中搜索新的miRNA 基因。該方法根據比較基因組學原理并結合生物信息軟件在已測序基因組中進行搜索比對，根據同源性的高低再進行RNA二級結構預測，將符合條件的候選miRNA與已經通過實驗鑒定的miRNA分子進行比較分析，最終確定該物種miRNA的分布及數量。近年來隨著miRNA預測方法的不斷發展，人們發現的miRNA數量呈幾何級數增長。這些預測方法從簡單的序列比對搜索發展到現在的機器學習算法，程序設計越來越智能化，復雜化。

 

隨著人miRNA基因轉錄出的pri-miRNA迅速加工成具有莖環結構的pre-miRNA，隨后被切割成miRNA：miRNA*雙體，并被選擇性地組合進核糖核酸沉默誘導復合體（RISC）并進行靶基因識別。在相似的物種中，miRNA是很保守的；但在相距較遠的物種間，miRNA又有一定的分歧，尤其體現在pre-miRNA上。這些miRNA功能作用機制的闡明為預測軟件的研發提供了理論依據，但仍需要不斷修補和完善。近年來，幾個基于這些規則的miRNA預測程序先后被開發(表1.1)，并被廣泛使用。

 

程序名	發布于	預測目標	適用方式	算法	輸入序列格式	適用長度	涉及的程序	適用于
miRscan	2003	Pre-miRNA	Web	N	兩物種比對序列	<100bp	Blast	線蟲
miRseeker	2003	Pre-miRNA	Local	N	—	—	Mfold、AVID、Blast	果蠅
ERPIN	2001	Pre-miRNA	Local/Web	—	Fasta序列、Fasta文件	—	Blast	動植物
Srnaloop	2003	Pre-miRNA	Local	N	Fasta序列	—	RepeatMasker、Blast、RNAfold	線蟲
MIRFINDER	2004	Pre-miRNA	Local	SVM	兩物種比對序列	—	RNAfold、RepeatMasker、PatScan、RNAVIZ	植物
PalGrade	2005	Pre-miRNA	Local	SVM	基因組序列	—	RNAfold	人
MiRAlign	2005	Pre-miRNA	Web	N	Fasta序列	50-300bp	RNAfold、ClustalW、RNAforester	動植物
microHARVESTER	2005	Pre-miRNA & miRNA	Web	N	pre-miRNA、miRNA	<450bp	RNAfold、Blast、T-Coffee	植物
findMiRNA	2005	Pre-miRNA & miRNA	Local	N	Fasta序列	—	RNAfold、Blast、mfold	擬南芥
miR-abela	2005	Pre-miRNA	Web	SVM	Fasta序列、Fasta文件	<1000bp	RNAfold、SVMlight	動物
BayesMiRNAfind	2006	Pre-miRNA & miRNA	Web	NBS	Fasta序列	<500Kbp	Mfold、BLAT	動物
ProMiRⅡ	2006	Pre-miRNA & miRNA	Local/Web	HMM	序列(只包含A、G和C，T或U)	70-150bp	RNAfold、Blast、pipeline vist、HMmiRNApairwise	動物
Vmir	2006	Pre-miRNA	Local	—	基因組序列	<2Mbp	RNAfold、mFold	病毒
RNAz+RNAmicro	2006	Pre-miRNA	Local	SVM	多物種比對序列	<400bp	RNAz、libSVM	動物
Microprocessor SVM	2006	Drosha剪切位點	Local/Web	SVM	Fasta序列	<180bp	RNAfold、ScorePin、 Gist SVM	動物

 

2) miRNA的靶基因預測方法

 

miRNA的研究意義之重大是毋庸置疑的。然而，與新的miRNA的頻頻發現相比，miRNA的功能研究相對緩慢。到目前為止，在發現的4449多個miRNA中，確定功能的miRNA僅有幾十個。導致miRNA功能研究進展緩慢的非常重要的原因是miRNA的作用靶標難以確定。事實上，通過實驗方法確定miRNA的作用靶標非常耗時，目前尚無高通量的靶標鑒定方法。因此，通過理論方法預測miRNA的作用靶標成為當前識別miRNA作用靶標的較為理想的途徑。以下重點介紹幾種經典預測軟件的算法分析，其他軟件（表1.2）請查看相應網站

 

表1.2  miRNA靶序列預測程序及查詢數據庫 Table1.2 miRNA target prediction programs and related databases
靶序列預測程序	適用物種	相關網站
EMBL miRtarget prediction	果蠅	http://www.russell.embl-heidelberg.de/miRNAs
miRanda	果蠅，脊椎動物	http://microrna.org/miranda.html
PicTar	脊椎動物，果蠅	http://pictar.bio.nyu.edu
TargetScan,TargetScanS	脊椎動物	http://genes.mit.edu/targetscan
RNA hybrid	果蠅	http://www.techfak.uni-bielefeld.de/persons/marc/mirna/targets
ViTa	病毒	http://vita.mbc.nctu.edu.tv
miTargert	動物	http://cbit.snu.ac.kr/~miTarget
MovingTarget	果蠅	——
MiRTif	動物	http://mirtif.bii.a-star.edu.sg
miRacle	動物	http://miracle.igib.res.in/miracle
PatScan	植物	Rhoades et al. (2002)
microTar	動物	http://tiger.dbs.nus.edu.sg/microTar
EIMMo	人，果蠅，線蟲，斑馬魚	http://www.mirz.unibas.ch/ElMMo
miRU	植物	http://bioinfo3.noble.org/miRNA/miRU.html
DIANA-MicroT	人，鼠	http://diana.pcbi.upenn.edu/DIANA-microT
RNA22	動物	http://cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html
MicroInspector	動植物、病毒	http://mirna.imbb.forth.gr/microinspector
試驗驗證靶序列數據庫
mirBase		http://www.microrna.sanger.ac.uk/targets/v2
TarBase		http://www.diana.pcbi.upenn.edu/tarbase.html
Argonaute		http://www.rna.uni-heidelberg.de/apps/zmf/argonaute/interface
miRNAMAP		http://mirnamap.mbc.nctu.edu.tw
miRGen		http://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/Targets.cgi

　

 

 

miRNA和siRNA之間的關系令人迷惑。從表面上說，一個是非編碼的單鏈小分子RNA，在進化上高度保守，通過翻譯抑制調控基因表達而不影響轉錄本的穩定性；另一個是針對編碼區的雙鏈小分子RNA，每個轉錄本都可能有很多個siRNAs，是通過降解目標靶，在轉錄后調控基因表達。由于每個mRNA模版可能產生很多個siRNAs，要給每個siRNA定一個基因的名字就很困難。miRNA是進化進程中高度保守的，因此給直向同源物一個同樣的名字可能有助于了解他們的功能，而給另一個物種中一段無關的序列一個同樣的名字就容易造成混亂。

 

然而，據推測miRNAs通常是由較大的（70­90 nt）的莖環結構（發夾結構）前體經Dicer酶切割得到的，而Dicer同樣負責將長雙鏈RNA切割為siRNA，而且二者的長度也差不多，同樣有調控基因表達功能。因而這兩類小分子RNA之間的關系格外令人關注。

 

兩個廣為人知的miRNA——在線蟲中首次發現的lin-4 和let-7，可以通過部分互補結合到目的mRNA靶的3’非編碼區(3’UTRs)，通過一種未知方式誘發蛋白質翻譯抑制從而抑制蛋白質合成。這種結合并不誘導mRNA靶的降解，就是說作為翻譯抑制子本身不影響對應mRNA的豐度，其原因據推測是由于miRNA和結合位點之間不完全互補。這就區別于siRNA的介導的mRNA的降解。但是其他一些miRNAs可能以類似siRNA的方式介導目的RNA的降解。實驗表明引入和let-7目的mRNA靶完全互補的miRNA會誘導mRNA靶的降解。還有實驗結果表明一些miRNA，包括在植物中發現的Scarecrow miRNA，能結合完全互補的mRNA鏈從而降解mRNA序列，抑制蛋白合成。這提示miRNAs可以和siRNAs一樣作用，這兩種小分子RNA作用通路可能有重疊的部分。這種重疊同樣提示siRNAs可能也有和miRNAs同樣的功能。

 

一個很有趣的實驗證實這個觀點：Doench和同事挑選一個已知在體內可以有效使CXCR4基因沉默的siRNA，然后在熒光素酶報告基因的3’端插入對應的CXCR4結合位點——其中一個拷貝是插入一個完全匹配的CXCR4結合位點，另一個拷貝插入4個只有3’和5’端匹配，而中間不同的CXCR4結合位點，這樣選定的siRNA就不能完全結合到這個結合位點——中間形成一個突起的不匹配的環。將這兩個拷貝轉入Hela細胞并用siRNA誘導基因沉默。結果很有趣——兩個實驗都錄得熒光素酶活性下降了超過10倍，RT-PCR和Northern分析證實，第一個實驗的熒光素酶轉錄本下降了超過10倍，這正是正常的siRNA介導的RNAi反應，目標靶mRNA降解導致表達水平的下降，而第二個實驗中熒光素酶轉錄本僅僅下降1.2倍，這種目的基因表達水平下看起來象源于miRNA介導的翻譯抑制降，而不是siRNA介導的影響mRNA的穩定性導致。實驗表明：siRNA可能以miRNA的方式作用于mRNA。實驗人員還進行了另一個實驗：改變第二個實驗中的不匹配環的堿基序列看起來不影響抑制效果，但是siRNA和報告基因上的結合位點的匹配程度越高抑制效果越好，增加siRNA的量，抑制效果越好——這一點和siRNA抑制的情況一樣——唯一不同的是：完全匹配的結合位點（siRNA作用方式）可以單獨起作用而相互不影響，而增加不完全配對的結合位點（注意在第二個實驗中用了4個CXCR4結合位點）的個數對翻譯抑制有顯著的加乘作用。

 

在哺乳動物細胞中還沒有找到內源的siRNA，外源的siRNA介導的RNAi作用正是一種抵御機制。而miRNAs則廣泛存在于哺乳動物細胞中，從理論上推測可能參與多種調控作用。這兩種小東西的作用機制和相互關系的本質就顯得更加撲朔迷離。如何在實驗中正確鑒定siRNA和miRNA，甚至是其他的小分子RNA都成為一個值得關注的問題。

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2017第四屆非編碼RNA和表觀遺傳學研究經驗交流會

會議時間：2017.6.10 -6.11      會議地點：廣州·科學城

會議詳情： http://www.cnaf.org.cn/2017ncrna/