基因甲基化特異性PCR擴增（MSP）試劑盒產品說明書(中文版)

主要用途

基因甲基化特異性PCR擴增（MSP）試劑盒是一種旨在通過設計符合胞嘧啶轉化的特殊引物，對轉化基因組的CpG島區域進行PCR擴增，探測基因甲基化信息的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。可以被用于父母印記、X染色體研究、腫瘤抑制基因等表觀遺傳學研究。產品即到即用，性能穩定，操作簡便，擴增效率顯著。

技術背景

在基因的啟動子區域（promotor region）通常存在一些富含重復雙核苷酸“CG”的區域，稱為“CpG島”（CpG island）。在人類基因組內，存在有近3萬個CpG島。這些CpG島不僅是基因的一種標志，而且還參與基因表達的調控和影響染色質的結構，更是DNA甲基化的唯一位置。CpG島甲基化形態的掃描分析是基因表達和表觀基因組學的主要課題。

產品內容

擴增液（Reagent A） 900微升

補充液（Reagent B）   1毫升

產品說明書   1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

轉化樣品：經過亞硫酸鹽轉化的目標DNA分子

特異引物：用于甲基化基因擴增的引導DNA分子

PCR儀：用于樣品擴增

PCR管或平板：用于PCR反應的容器

實驗步驟

實驗開始前，從－20℃冰箱中取出試劑，放進冰槽里融化。然后進行下列操作：

• 針對一個樣本，每次移出15微升擴增液（Reagent A）到PCR管
• 加入1微升用戶自備的的轉化或野生型DNA樣品（總量100納克）
• 分別加入1微升用戶自備的甲基化特異性的引物F和引物R（各350納克或25微摩爾）
• 再加入7微升補充液（Reagent B）（反應總量為25微升）
• 即刻放進微型臺式離心機瞬時離心5秒，速度為500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）
• 加入50微升PCR級礦物油（注意：參見注意事項10）
• 即刻進行熱啟動PCR反應：

• 反應完畢后，移取5微升進行1.8%瓊脂糖凝膠電泳或15%聚丙烯酰胺凝膠
• 如果進行測序鑒定，膠回收PCR產物（建議使用高質純化一步法膠回收試劑盒；20051.1）
• 分別移出2微升反應液到2個不同的新的1.5毫升離心管（每微升100納克）
• 加入1微升用戶自備的甲基化特異性的巢式引物F（每微升350納克）到其中一個1.5毫升離心管，作好標記
• 加入1微升用戶自備的甲基化特異性的巢式引物R（每微升350納克）到另一個1.5毫升離心管，作好標記
• 進行后續的直接測序反應

注意事項

• 本產品為60次操作
• 操作時，須戴手套
• 建議使用帶濾芯的槍頭，避免污染
• 轉化后的DNA樣本須保存在－20℃冰箱里，否則容易降解；同時盡快進行擴增等后續操作
• 一個特定基因的甲基化檢測通常包括轉化、PCR和直接測序三步。PCR用于篩選和定位，可以發現0.1%甲基化；測序是精確定位，是分析金標準
• 一個特定基因的甲基化特異性PCR通常包括三組PCR：野生型（W）、轉化后甲基型（M）、轉化后非甲基型（U）
• 甲基化特異性PCR的引物設計原則：引物以SENSE的DNA鏈為模板；引物含有足夠多的C（后面不和G相連）；引物含有1－3個CpG位點；CpG位點須在3端；PCR片段長度在80－250堿基；三組引物取自同一位點，通過長度變化獲得相同的Tm，并在電泳上有所區別。
• 直接測序的引物設計原則是：引物不能含有CpG位點；引物含有足夠多的C（不和G相連）；采用巢式引物
• 基因甲基化區域選擇原則：如果是一個首次檢測的基因，首先，選擇啟動子部位；第二，選擇足夠多的CpG位點；第三、選擇200堿基以上區域，且GC超過50%
• 通過1.8%瓊脂糖凝膠或15%聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測PCR擴增后的結果。假如DNA樣品在修飾前是未甲基化的，那么僅僅“U”Primers將產生擴增產物；相反，已甲基化的DNA樣品僅僅用“M”Primer能被擴增

• 組織樣品或雜合子樣品常常出現“U”和“M”同時呈現陽性；建議使用基因甲基化程度定量分析試劑盒（20024.3）予以分析
• 根據用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）
• 建議使用軟件測算Tm溫度；參考公式為Tm=4（G+C）+2（A+T）
• 在－20℃冰箱里儲存的產品避免反復凍融
• 本公司提供甲基化特異性引物設計服務
• 本公司同時提供數字化表觀基因組完全分析（全部甲基化基因）技術試劑盒和外包服務（90002）
• 本公司提供系列甲基化分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定轉化保證
• 本產品經鑒定無核酶污染
• 本產品經鑒定反應產量高