《Cell》重磅！全轉錄組測序技術揭示circRNA新的調控機制！
2月7日，加拿大多倫多大學的Paul C. Boutros教授和Housheng Hansen He教授團隊對144例前列腺癌樣本進行全轉錄組測序，結合后續的功能機制研究，揭示了前列腺癌circRNA新的調控機制！該研究成果以題為“Widespread and Functional RNA Circularization in Localized Prostate Cancer”發表在著名學術期刊《Cell》(IF 31.4)上。接下來，就一起來看下研究人員是如何利用高通量測序技術RNA-seq和大規模shRNA文庫技術揭示circRNA在局限性前列腺癌中表達特征和生物功能的。
文章導讀：
前列腺癌是人類特有的疾病，在歐美是男性最常見的惡性腫瘤之一，在美國前列腺癌發病率占第1位，死亡率僅次于肺癌。加拿大多倫多大學的研究者首先選取了144例有詳細臨床信息的前列腺癌樣本，進行全轉錄組測序（RNA-seq），共識別鑒定了7千多個circRNA分子，經生物信息學分析顯示，這些circRNA的表達特征與前列腺癌侵襲轉移特性密切關聯，隨后采用大規模shRNA文庫技術進行敲除驗證，發現其中約11.3% circRNA是前列腺癌細胞增殖特性密切相關，并且這些circRNA來源基因的線性轉錄本不影響細胞增殖，表明circRNA特殊的功能。最后研究人員重點關注前列腺癌顯著相關的circCSNK1G3，揭示circCSNK1G3可以與miR-181相互作用調控細胞增殖發揮，有別于現階段研究較多的circRNA海綿機制，該circRNA在前列腺癌中穩定了miR-181的活性，這一發現提供了circRNA全新的研究思路。
前列腺癌是人類特有的疾病，在歐美是男性最常見的惡性腫瘤之一，在美國前列腺癌發病率占第1位，死亡率僅次于肺癌。加拿大多倫多大學的研究者首先選取了144例有詳細臨床信息的前列腺癌樣本，進行全轉錄組測序（RNA-seq），共識別鑒定了7千多個circRNA分子，經生物信息學分析顯示，這些circRNA的表達特征與前列腺癌侵襲轉移特性密切關聯，隨后采用大規模shRNA文庫技術進行敲除驗證，發現其中約11.3% circRNA是前列腺癌細胞增殖特性密切相關，并且這些circRNA來源基因的線性轉錄本不影響細胞增殖，表明circRNA特殊的功能。最后研究人員重點關注前列腺癌顯著相關的circCSNK1G3，揭示circCSNK1G3可以與miR-181相互作用調控細胞增殖發揮，有別于現階段研究較多的circRNA海綿機制，該circRNA在前列腺癌中穩定了miR-181的活性，這一發現提供了circRNA全新的研究思路。
研究內容：
1. 局限性前列腺癌的表達譜分析
1. 局限性前列腺癌的表達譜分析
作者通過全轉錄組測序（云序生物提供此項服務）技術，對144例前列腺癌標本進行轉錄組分析，以圖片的形式展示總RNAs (n=38,359) 和高豐度技術，對144例前列腺癌標本進行轉錄組分析，以圖片的形式展示總RNAs (n=38,359) 和高豐度RNAs (n=18,152)在各樣本中的分布，并且對每個樣本中高豐度的RNA進行聚類分析，以展示個樣本間的差異。通過融合基因分析，大量的融合基因轉錄本被識別，超過10%的SU2C轉移性轉錄組發現復發融合，揭示了融合基因與侵襲性局限性疾病有關。
2. 局限性前列腺癌環狀RNA表達譜
作者使用CIRCexplorer共鑒定識別到了76311個circRNA分子，其中還包括62個融合基因來源的circRNA分子，并且通過RNase R和擴大樣本量對高可信度環狀RNA分子進行驗證。找到組織細胞特異性表達的環狀RNA，以及它們在不同組織類型中表達模式；通過circBase數據庫的環狀RNA進行前列腺疾病相關分析，同時對環狀RNA對應的親本基因來源的線性轉錄本進行分析，探討circRNA與線性RNA的相關性。
3. 環狀RNA的差異表達與前列腺癌的進展有關
研究者對144個前列腺癌進行了聚類分析，與線性RNA相比，環狀RNA最強模式與它們在每個樣本中的總體豐度相一致。另外，極端circRNA分布的患者的預后明顯較circRNA分布穩定的患者差，同時極端circRNA index組也與更高的轉移發生率相關。這種相關性排除了對應親本來源的線性轉錄本的影響，種種跡象表明這種特異性表達的circRNA與前列腺癌的發生發展密切相關。
研究者對144個前列腺癌進行了聚類分析，與線性RNA相比，環狀RNA最強模式與它們在每個樣本中的總體豐度相一致。另外，極端circRNA分布的患者的預后明顯較circRNA分布穩定的患者差，同時極端circRNA index組也與更高的轉移發生率相關。這種相關性排除了對應親本來源的線性轉錄本的影響，種種跡象表明這種特異性表達的circRNA與前列腺癌的發生發展密切相關。
為了評估這些特異性circRNA的功能重要性，選取前列腺癌細胞系中數量最多的2000個環狀RNA進行shRNA功能缺失篩選，位點靶向于反式剪切序列，然后對這些環狀RNA敲除細胞系進行全轉錄組測序，同時耗盡其中的線性RNA以保證篩選的有效性，結果表明這些特異性的circRNA對細胞的增殖產生明顯的促進作用，而不是線性RNA。
4. circCSNK1G3的功能特征
環狀RNA分子circCSNK1G3非常特殊，其環狀和線性形式表達豐度相似，經驗證發現環狀RNA形式在四種前列腺癌細胞系中是必不可少的，相反的，其對應線性轉錄本則是非必須的。為了研究circCSNK1G3促進細胞增殖的機制，研究者在PC-3細胞系中對circCSNK1G3進行敲除和過表達后進行全轉錄組測序（RNA-seq）分析。GSEA富集分析顯示過表達樣品中上調的許多基因在敲除樣品中下調，反之亦然。另外兩種環狀RNA circSTAU2和circGOLPH3也出現了類似的模式，說明在敲除和過表達實驗中觀察到的表型并不是由靶外效應引起的。同時，敲除其線性轉錄本CSNK1G3后，并沒有這種現象。最終證實circCSNK1G3對前列腺癌細胞增殖的促進作用與其對應線性轉錄本無關。
環狀RNA分子circCSNK1G3非常特殊，其環狀和線性形式表達豐度相似，經驗證發現環狀RNA形式在四種前列腺癌細胞系中是必不可少的，相反的，其對應線性轉錄本則是非必須的。為了研究circCSNK1G3促進細胞增殖的機制，研究者在PC-3細胞系中對circCSNK1G3進行敲除和過表達后進行全轉錄組測序（RNA-seq）分析。GSEA富集分析顯示過表達樣品中上調的許多基因在敲除樣品中下調，反之亦然。另外兩種環狀RNA circSTAU2和circGOLPH3也出現了類似的模式，說明在敲除和過表達實驗中觀察到的表型并不是由靶外效應引起的。同時，敲除其線性轉錄本CSNK1G3后，并沒有這種現象。最終證實circCSNK1G3對前列腺癌細胞增殖的促進作用與其對應線性轉錄本無關。
5. circCSNK1G3協同穩定miR-181b/d活性促進前列腺癌
環狀RNA通常與miRNA相互作用發揮調控功能，首先通過預測找到了10個與circCSNK1G3作用的候選miRNA，進一步分析了circCSNK1G3與miRNA之間的相關性，最終確定了與circCSNK1G3表達顯著相關的5個miRNA，分別是miR-181a/b/c/d和miR-196b。通過circCSNK1G3 pull down（云序生物提供此項服務）實驗發現只有miR-181b/d顯著富集，敲除circCSNK1G3降低miR- 181b/d豐度，過表達增加miR- 181b/d豐度。對ciRS-7也有類似的現象，敲除ciRS-7降低了其相互作用的miR-7。PC-3細胞系中miR-181b/d 過表達顯著降低CBX7豐度，CBX7是一種特征良好的miR-181b靶點，也是前列腺癌的腫瘤抑制因子。與miR-181b/d在circCSNK1G3敲低后下調一致，CBX7豐度顯著增加。同樣的，在miR-181b/d 過表達細胞系中，細胞周期基因如CDK1、CDC25A上調，而在circCSNK1G3敲除細胞系中下調。與細胞周期基因上調一致，miR-181b/d過表達可促進PC-3細胞增殖。更重要的是，miR-181b/d的過表達顯著減弱了circCSNK1G3的敲除誘導的細胞增殖阻滯。綜上所述circCSNK1G3通過與miR-181b/d的相互作用促進前列腺癌細胞的增殖，且這種新的調控方式有別于海綿機制。
環狀RNA通常與miRNA相互作用發揮調控功能，首先通過預測找到了10個與circCSNK1G3作用的候選miRNA，進一步分析了circCSNK1G3與miRNA之間的相關性，最終確定了與circCSNK1G3表達顯著相關的5個miRNA，分別是miR-181a/b/c/d和miR-196b。通過circCSNK1G3 pull down（云序生物提供此項服務）實驗發現只有miR-181b/d顯著富集，敲除circCSNK1G3降低miR- 181b/d豐度，過表達增加miR- 181b/d豐度。對ciRS-7也有類似的現象，敲除ciRS-7降低了其相互作用的miR-7。PC-3細胞系中miR-181b/d 過表達顯著降低CBX7豐度，CBX7是一種特征良好的miR-181b靶點，也是前列腺癌的腫瘤抑制因子。與miR-181b/d在circCSNK1G3敲低后下調一致，CBX7豐度顯著增加。同樣的，在miR-181b/d 過表達細胞系中，細胞周期基因如CDK1、CDC25A上調，而在circCSNK1G3敲除細胞系中下調。與細胞周期基因上調一致，miR-181b/d過表達可促進PC-3細胞增殖。更重要的是，miR-181b/d的過表達顯著減弱了circCSNK1G3的敲除誘導的細胞增殖阻滯。綜上所述circCSNK1G3通過與miR-181b/d的相互作用促進前列腺癌細胞的增殖，且這種新的調控方式有別于海綿機制。
總結
總結一點：有充足的經費，有充足的樣本，利用新分子circRNA做分子標志物，結合機制，登頂CNS不再遙遠。
云序生物環狀RNA平臺優勢:
環狀RNA“一站式”服務一直以來是云序生物的主打產品，嚴格的質控把關、嚴謹的實驗設計、出色的生信分析以及貼心的售后服務造就了多項世界首篇環狀RNA研究文章，受到了廣大客戶的一致好評。迄今為止，云序已經積累了超過10000例環狀RNA測序的經驗，樣本覆蓋20多個物種以及50多種疾病，客戶發表文章達20篇以上。此外云序生物提供環狀RNA系統性解決方案，從環狀RNA篩選、驗證、機制一條龍覆蓋，為科研客戶打造高分文章。
總結一點：有充足的經費，有充足的樣本，利用新分子circRNA做分子標志物，結合機制，登頂CNS不再遙遠。
云序生物環狀RNA平臺優勢:
環狀RNA“一站式”服務一直以來是云序生物的主打產品，嚴格的質控把關、嚴謹的實驗設計、出色的生信分析以及貼心的售后服務造就了多項世界首篇環狀RNA研究文章，受到了廣大客戶的一致好評。迄今為止，云序已經積累了超過10000例環狀RNA測序的經驗，樣本覆蓋20多個物種以及50多種疾病，客戶發表文章達20篇以上。此外云序生物提供環狀RNA系統性解決方案，從環狀RNA篩選、驗證、機制一條龍覆蓋，為科研客戶打造高分文章。
全文鏈接：
https://sci-hub.tw/10.1016/j.cell.2019.01.025
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